大鼠DAF功能區(qū)的原核重組表達純化和功能鑒定.pdf

1、補體激活造是炎癥反應(yīng)性疾病的病理反應(yīng)之一。如何能夠控制補體的激活是當(dāng)前科學(xué)研究的一個熱點。 促衰變因子(DAF)屬膜補體調(diào)節(jié)蛋白，是一種錨定于細胞膜表面的蛋白質(zhì)。可以促進經(jīng)典、旁路途徑C3、C5轉(zhuǎn)化酶的解離并防止其組裝，這對其宿主細胞起到了重要的保護作用?？扇苄訢AF的表達在過去已經(jīng)有過非常多的嘗試，但多為帶有真核細胞分泌信號肽的方式表達。由于DAF有4個短的保守重復(fù)序列(SCR)，含有多達8對二硫鍵，原核核細胞表達都以包涵體告

2、終。本研究擬采用大腸桿菌表達Trx融合蛋白的方式來表達大鼠DAF的4個SCR，以期得到可溶性的表達產(chǎn)物。 首先通過PCR的方法，將編碼大鼠DAF四個SCR的基因片段亞克隆到Trx融合原核表達載體pET32a(+)。再將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)pLysS。 通過比較3種不同的誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度，經(jīng)WesternBlot檢測，發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)確實能夠增加可溶性蛋白的量，但效果并不是很明顯。通過Ni2

3、+親和層析分離出了可溶性組分，經(jīng)WesternBlot檢測，進一步確認了該可溶性成分確實為帶有His標(biāo)簽的融合蛋白。 按標(biāo)準(zhǔn)的37℃，1mmol/LIPTG誘導(dǎo)4h的方案，得到了大量包涵體。通過包涵體復(fù)性，得到了具有抑制致敏綿羊紅細胞發(fā)生溶血的蛋白。 綜上所述，本研究采用的Trx融合蛋白的方式表達DAF的4個SCR同樣以大量的包涵體告終，但通過低溫低IPTG濃度長時間誘導(dǎo)的方式帶來了可溶性表達量的提高確實為含有SCR蛋白