BIG-3基因的克隆、表達(dá)及其促成骨活性的研究.pdf

1、BIG-3在體外加速軟骨細(xì)胞的分化和成熟,在小鼠胚胎發(fā)育期BIG-3的表達(dá),表明BIG-3可能是軟骨細(xì)胞分化和增生肥大的調(diào)節(jié)因子.同時(shí),BIG-3在成骨細(xì)胞中表達(dá)并能加速成骨細(xì)胞的分化,表明BIG-3蛋白參與體內(nèi)軟骨內(nèi)骨形成過(guò)程.一.該組實(shí)驗(yàn)首先采用生物軟件分析了小鼠和人BIG-3基因全長(zhǎng)編碼序列的同源性和序列的一致性.二.使用Genbank檢索BIG-3基因序列,根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物并交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;從新

2、生小鼠顱骨中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR得到全長(zhǎng)BIG-3產(chǎn)物;將載體和PCR產(chǎn)物雙酶切,經(jīng)連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆,構(gòu)建原核表達(dá)載體并對(duì)重組子pGEX-4T-2-BIG-3進(jìn)行序列測(cè)定.結(jié)果顯示所得的目的基因的序列與從GenBank中檢索到的序列完全一致.三.重組子pGEX-4T-2-BIG-3轉(zhuǎn)化BL21菌株后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在60kDa處出現(xiàn)新生表達(dá)帶,與預(yù)期分子量相符.用IPTG誘導(dǎo)1L收集細(xì)菌,超聲裂菌,離心,棄上

3、清,沉淀用8M尿素變性后梯度稀釋復(fù)性,在尿素濃度達(dá)2M時(shí)使用親和層析柱Sepharose 4B純化表達(dá)產(chǎn)物,取電泳樣品行SDS-PAGE,證實(shí)得到高純度GST-BIG-3融合蛋白.四.用純化的GST-BIG-3蛋白免疫兔,制備多克隆抗體,用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定多克隆抗體的效價(jià),western bolt鑒定其特異性.結(jié)果制備了效價(jià)為1:128的多克隆抗體,且具有較高的特異性.五.制備pMSCVpuro-BIG-3質(zhì)粒,復(fù)蘇凍存的PT67細(xì)