人脂聯(lián)素基因的克隆、表達(dá)及其生物活性檢測.pdf

1、在過去的20多年，不論是發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，超重和肥胖已成流行態(tài)勢，與之相關(guān)的2型糖尿病、心血管疾病和高血壓等疾病的發(fā)病率也不斷攀升。因此人們把目光轉(zhuǎn)向了在這些疾病中扮演著重要角色的脂肪組織，隨著大量脂肪細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)，脂肪組織作為一種重要的內(nèi)分泌器官開始為人們所關(guān)注和重視。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的蛋白，具有抗胰島素抵抗、抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。 在對(duì)脂聯(lián)素近十年的研究中發(fā)現(xiàn)，低脂聯(lián)素水平不僅與胰島素抵抗以及2型糖尿病

2、相關(guān)，低脂聯(lián)素血癥還可出現(xiàn)在心血管疾病、高血壓、血脂異常等疾病中。血清脂聯(lián)素水平檢測可以做為胰島素抵抗和代謝綜合征的預(yù)測指標(biāo)；研究者認(rèn)為，血中脂聯(lián)素水平檢測與糖化血紅蛋白檢測一樣具有相同的重要性。因此血漿脂聯(lián)素水平將是輔助診斷代謝性疾病以及評(píng)價(jià)某些抗糖尿病藥物療效的極佳的實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)。 脂聯(lián)素是一種良好的胰島素增敏劑，其可直接作用于肝臟、骨骼肌，增強(qiáng)胰島素的敏感性。體外實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素是G6Pase的抑制劑，重組的脂聯(lián)素

3、蛋白，可作用于體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞，抑制糖異生，減少肝糖輸出。 研究目的：1.克隆和表達(dá)全長的脂聯(lián)素蛋白，以得到純化的重組蛋白和抗脂聯(lián)素的多克隆抗體。2.觀察重組脂聯(lián)素蛋白對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞G6Pase轉(zhuǎn)錄水平的影響，檢測重組蛋白的生物活性。 實(shí)驗(yàn)方法：1.從人的脂肪組織中提取總RNA,利用RT-PCR的方法得到人脂聯(lián)素基因全序列，構(gòu)建pMD18-T/adiponectin載體，經(jīng)PCR反應(yīng)使脂聯(lián)素DNA片段兩端加上attB位

4、點(diǎn)，將目的序列通過BP以及LR反應(yīng)克隆到表達(dá)載體pET-DEST42中，目的序列經(jīng)過測序鑒定；重組的陽性表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-DEST42/adiponectin。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DE3(BL21)感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。超聲碎菌，處理包涵體，在變性條件下純化蛋白，蛋白利用NDSB201結(jié)合谷胱苷肽復(fù)性、透析除鹽并超濾濃縮。蛋白純度經(jīng)SDS-PAGE鑒定，Bradford法蛋白定量 2.重組蛋白通過背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射的方法

5、，免疫兔子，每次蛋白量為100ug，8周后，頸靜脈取血，離心得到抗血清，用瓊脂雙擴(kuò)散法測抗體滴度。3.大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)后，在培養(yǎng)液中加入重組脂聯(lián)素，作用24小時(shí)，提取RNA，半定量RT-PCR的方法來測定重組蛋白對(duì)肝細(xì)胞G6Pase表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.得到脂聯(lián)素表達(dá)載體pET-DEST42/adiponectin經(jīng)測序證實(shí)其插入的目的片段無誤。2.得到純化復(fù)性后的重組蛋白以及兔抗人脂聯(lián)素抗血清。3.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組脂聯(lián)

6、素具備生物活性。重組脂聯(lián)素蛋白作用于大鼠原代肝細(xì)胞，濃度到達(dá)2000ng/ml即可抑制G6Pase的轉(zhuǎn)錄水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：利用Gateway表達(dá)體系可以快速準(zhǔn)確地獲得重組表達(dá)載體，與傳統(tǒng)方法比較，這個(gè)表達(dá)體系效率較高，但不同的蛋白還是需要慎重選擇合適的融合標(biāo)簽和表達(dá)載體。 重組的全長脂聯(lián)素蛋白在2000-5000ng/ml濃度范圍內(nèi)都可使葡萄糖-6-磷酸酶轉(zhuǎn)錄水平下降，在5000ng/ml時(shí)，可使轉(zhuǎn)錄水平下降約40％。因