豬β防御素-2定點(diǎn)突變基因的克隆表達(dá)及其活性分析.pdf

1、防御素是生物界廣泛存在的一類具有微生物抗性的低分子肽，其中哺乳動物防御素的抗菌譜最廣，具有很高的應(yīng)用潛力。豬β防御素-2以其廣譜高效的殺菌活性、不易使微生物對其產(chǎn)生耐藥性及細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)倍受人們的關(guān)注。本研究以豬β防御素-2氨基酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變，并對其定點(diǎn)突變基因進(jìn)行克隆表達(dá)及蛋白活性分析。具體的研究內(nèi)容如下：
　　 1.利用生物信息學(xué)手段，預(yù)測分析含有不同突變位點(diǎn)的PBD2理化性質(zhì)，從中選擇了二級結(jié)構(gòu)不變，凈電荷含

2、量增加、兩親性強(qiáng)、比較穩(wěn)定的突變點(diǎn)。
　　 2.以實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到的豬β防御素-2基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)合成含突變堿基的引物，通過PCR擴(kuò)增出8個(gè)定點(diǎn)突變基因序列(即mpBD2-1～8)，連接pMD19-T克隆載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ雙酶切之后連接到pET30a質(zhì)粒上后轉(zhuǎn)進(jìn)表達(dá)菌株BL21(DE3)PlysS中，成功構(gòu)建了不同突變點(diǎn)的工程菌株。
　　 3.對工程菌株BL21-pET30a-mpBD2-1～8進(jìn)行誘

3、導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明目的蛋白的分子量與預(yù)期的基本相符，并且目的蛋白的含量約占總蛋白含量的12.8％。經(jīng)超聲波破碎，鎳離子柱親和層析純化得到融合蛋白，純度可以達(dá)到90％以上。對其進(jìn)行抑菌活性和溶血活性分析。結(jié)果顯示，所有突變的防御素均對大腸桿菌利金黃色葡萄球菌有抑制作剛，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用更強(qiáng)一些。溶血試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些防御素的溶血率均低于5％，其細(xì)胞毒性很小。綜合分析篩選出了mPBD2-1、mPBD2-2、mPBD2-