雞MxA基因的克隆、表達(dá)及生物活性檢測.pdf

1、人、哺乳動物、魚類、家禽體內(nèi)都有Mx蛋白。Mx蛋白具有GTP酶活性，在其肽鏈氨基端均包含一個氨基酸序列高度保守的的三聯(lián)GTP結(jié)合區(qū)域，羧基端存在亮氨酸拉鏈區(qū)域。人的MxA蛋白具有抵抗流感病毒、水皰性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒、Thogoto病毒等。但是，人的MxB蛋白和鼠的Mx3蛋白卻無此抗病毒活性。此外，Mx2、Mx3在實(shí)驗(yàn)鼠中也未發(fā)現(xiàn)有抗病毒功能。家禽中鴨的Mx蛋白無抗病毒活性，雞的Mx蛋白的抗病毒活性受631位氨基酸的影響：當(dāng)6

2、31位氨基酸為天冬酰胺時有抗病毒活性，為絲氨酸時則無抗病毒活性。 雞MxAcDNA的全基因序列在國外早有報道，本文根據(jù)已發(fā)表的MxA蛋白的cDNA基因序列，設(shè)計一對特異性引物，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)從Poly：IC和干擾素(IFN)刺激7小時活化的新城疫病毒成纖維細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增出編碼MxA蛋白的全長基因，對擴(kuò)增片段進(jìn)行T-A克隆，經(jīng)PCR、酶切鑒定、測序驗(yàn)證，成功獲得MxA蛋白完整基因的克隆。在克隆

3、到編碼MxA蛋白的基因后，將此基因亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒并進(jìn)行確證性系列測定。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株DH5α中并用IPTG于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)，表達(dá)形式為包涵體。經(jīng)過優(yōu)化，選擇確定了重組MxA蛋白高校表達(dá)的最適參數(shù)，即當(dāng)IPTG濃度為0.4mmol/L，誘導(dǎo)時間為8h時，表達(dá)水平最高。北京亞力恩機(jī)電技術(shù)研究所研制開發(fā)的YLN2000凝膠影像分析系統(tǒng)分析顯示表達(dá)的融合蛋白約占菌體蛋白的30％。誘

4、導(dǎo)菌液裂解物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，結(jié)果初步確證了GST-MxA融合蛋白的表達(dá)，表達(dá)的雞MxA融合蛋白分子量約為45KD，并對其進(jìn)行了初步純化。 為了進(jìn)一步確定MxA蛋白的生物學(xué)活性，我們表達(dá)產(chǎn)物分離提純后首先進(jìn)行了雞胚新城疫病毒增殖干擾試驗(yàn)和VSV-CEF微量細(xì)胞抑制試驗(yàn)，證明MxA蛋白具有阻斷新城疫病毒和VSV病毒的作用，然后又進(jìn)行了小范圍的動物試驗(yàn)，結(jié)果顯示MxA蛋白對于雞新城疫的防治有良好的臨