多發(fā)性骨骺發(fā)育不良患者COMP基因突變的研究.pdf

1、中文摘要前言多發(fā)性骨N發(fā)育不良(MED)是一種少見的遺傳性骨軟骨發(fā)育不疾病，它是由于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白及細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等缺陷引起的全身性的骨器發(fā)育異常，其遺傳方式和臨床表現(xiàn)都具有異質(zhì)性。遺傳方式以外顯完全的常染色體顯性遺傳為主，少數(shù)病例為隱性遺傳。根據(jù)臨床表型可分為輕型(Ribbing型)、重型(Fairbank型)和未分類型，三型間沒有明確的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)。典型的表現(xiàn)是輕到中度身材矮小或正常和早期發(fā)作的骨關(guān)節(jié)炎，兒童早期即出現(xiàn)大關(guān)節(jié)

2、疼痛、僵硬，步態(tài)瞞珊，逐漸形成手指短粗，膝內(nèi)外翻等畸形，30%的患兒可有股骨頭壞死。國外對(duì)MED的研究已深人至分子水平，早在1994年MED的致病基因之一已被定位于19p13.1。隨后，BriggsMD等發(fā)現(xiàn)位于該區(qū)的COMP基因突變可引起MED。以后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其它3個(gè)MED的致病基因，分別是編碼IX型膠原蛋白a2鏈的COI9A2基因，。，鏈的C019A3基因，以及畸形發(fā)育不良硫酸鹽轉(zhuǎn)移因子(DTDST)基因。其中前三者的突變均導(dǎo)致顯性

3、遺傳的MED，后者與隱性遺傳的MED相關(guān)。COMP基因突變最常見，國外報(bào)道的MED患者中COMP基因突變占57%以上。COMP基因長(zhǎng)約26Kb，含有19個(gè)外顯子。目前國外MED患者中已發(fā)現(xiàn)了9種點(diǎn)突變以及1種插人性突變和1種缺失性突變，分布在從第9到第16外顯子之間的6個(gè)外顯子上，其中外突變發(fā)生率較高。國內(nèi)尚無該病的分子遺傳學(xué)研究的報(bào)道本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR一SSCP)技術(shù)結(jié)合DNA測(cè)序方法，對(duì)10例臨床診斷ME

4、D的患者及10名父母和30例正常人進(jìn)行COMP基因第1013和14外顯子突變檢10分鐘后，立即置人冰中，電泳采用8%的非變性聚丙烯酞胺凝膠(交聯(lián)度491，凝膠大小為20cmx18cmx0.75cm)1xTEE緩沖液，300V恒壓電泳4一5小時(shí)，電泳系統(tǒng)溫度保持在10一149C。硝酸銀染色后在自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)上成像。4.PCR一產(chǎn)物純化和測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒(DNAGelExtractionKit，上海Sangon公司)純化后

5、測(cè)序，側(cè)序應(yīng)用ABIPRISMTM377XLDNASequencer，由大連TaKaRa公司完成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.PCR一SSCP分析的結(jié)果正常對(duì)照均為相同帶型。所有患者及父母中僅有1例散發(fā)的重型患者(編號(hào)M一1一1)的外顯子14的PCR產(chǎn)物存在單鏈泳動(dòng)變位，其表型正常的母親SSCP帶型與正常對(duì)照相同。2.DNA序列分析結(jié)果單鏈泳動(dòng)異常的PCR產(chǎn)物側(cè)序結(jié)果與Genbank中COMP基因正常序列比較，發(fā)現(xiàn)該患兒COMP基因的第14內(nèi)含子的5’

6、端第22位堿基發(fā)生純合性GA轉(zhuǎn)換(圖一2)。外顯子14的堿基序列與Genbank中的序列完全相同。討論軟骨寡聚物基質(zhì)蛋白是一種鈣結(jié)合蛋白，主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞周圍基質(zhì)中。它是一種同源五聚體糖蛋白，分子量524KD，分子構(gòu)成包括氨基端區(qū)域，類表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)區(qū)，類鈣調(diào)蛋白(Calmodulin一Eke)重復(fù)區(qū)和球狀赦基端區(qū)。類鈣調(diào)蛋白區(qū)是高度保守的鈣離子結(jié)合區(qū)，通過電荷間相互作用與鈣結(jié)合。COMP基因的第4一19外顯子編碼類EGF重復(fù)，類鈣