遺傳性多發(fā)性外生性骨疣及骨斑點(diǎn)癥的致病基因突變研究.pdf

1、第一部分四個(gè)中國(guó)漢族遺傳性多發(fā)性外生性骨疣家系的致病基因突變研究
　　 目的：
　　 遺傳性多發(fā)性外生性骨疣(hereditary multiple exostoses，HME)是一種累及軟骨化骨的以骨骼系統(tǒng)多發(fā)性外生性骨疣為特征的疾病，常見(jiàn)于長(zhǎng)骨干骺端。HME發(fā)病率在西方人群約1/50，000，為常染色體顯性遺傳病，具有遺傳異質(zhì)性，目前研究結(jié)果顯示該病致病基因主要為EXT1和EXT2基因。
　　 EXT1基因定

2、位于8q24.11-q24.13，全長(zhǎng)約250kb，包含11個(gè)外顯子，編碼746個(gè)氨基酸。EXT2基因定位于11p11-p12，基因長(zhǎng)約110kb，包含14個(gè)外顯子，編碼718個(gè)氨基酸。EXT1基因和EXT2基因分別編碼Exostosin-1蛋白和Exostosin-2蛋白，它們均為Ⅱ型跨膜糖蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，二者均為具有D-葡萄糖醛酸(GlcA)轉(zhuǎn)移酶活性和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)轉(zhuǎn)移酶活性的硫酸乙酰肝素聚合酶(HS

3、-Pol)，參與硫酸乙酰肝素的合成。Exostosin-1與Exostosin-2形成異源二聚體，該二聚體相比于二者單獨(dú)存在時(shí)其糖基轉(zhuǎn)移酶的活性大大增高。到目前為止，與HME相關(guān)的EXT1基因突變已經(jīng)超過(guò)429種，EXT2基因突變已經(jīng)超過(guò)222種，大多數(shù)突變是產(chǎn)生移碼的插入突變和缺失突變，無(wú)義突變和剪接位點(diǎn)的突變也有所報(bào)道。
　　 本文以4個(gè)中國(guó)漢族HME家系為研究對(duì)象，對(duì)EXT1和EXT2基因進(jìn)行DNA測(cè)序來(lái)篩查突變，通過(guò)限制

4、性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP）對(duì)突變進(jìn)行驗(yàn)證，排除單核苷酸多態(tài)性(Single NucleotidPolymorphism，SNP)。并對(duì)所篩查到的剪接位點(diǎn)突變，聯(lián)合應(yīng)用體外剪接分析工具及體內(nèi)mRNA水平檢測(cè)進(jìn)行剪接位點(diǎn)突變所導(dǎo)致的異常剪接效應(yīng)分析。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院和遼寧省人民

5、醫(yī)院收集的4個(gè)中國(guó)漢族HME家系，臨床表現(xiàn)與HME既往報(bào)道相符，臨床診斷明確。在簽署書(shū)面的知情同意書(shū)后，對(duì)家系中4名先證者采集血樣（其中患者4例，男2例、女2例）。
　　 二、方法
　　 1、致病基因EXT1和EXT2的DNA測(cè)序
　　 PCR擴(kuò)增患者EXT1和EXT2基因所有外顯子及包括剪接位點(diǎn)的側(cè)翼序列，PCR產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行DNA測(cè)序。
　　 2、PCR-RFLP分析
　　 根據(jù)測(cè)序發(fā)現(xiàn)的

6、突變?cè)O(shè)計(jì)1個(gè)錯(cuò)配引物，引入PmaCⅠ限制性酶切位點(diǎn)。在100名無(wú)關(guān)正常個(gè)體中進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析。
　　 3、EXT1和EXT2基因突變的體外mRNA水平分析
　　 我們應(yīng)用MINIpCAS載體，分別構(gòu)建EXT1和EXT2基因野生型和剪接位點(diǎn)突變型的MINIGENE轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，RT-PCR分析后，測(cè)序?qū)Ρ纫吧秃屯蛔冃蚆INIGENE cDNA的改變，體外驗(yàn)證剪接位點(diǎn)突變后所引起的異常剪接效應(yīng)。
　　

7、 4、EXT1基因突變的體內(nèi)mRNA水平分析
　　 從家系1先證者新鮮血液樣本中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，RT-PCR擴(kuò)增包括突變位點(diǎn)及其上下游外顯子的片段，測(cè)序驗(yàn)證所產(chǎn)生的異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、基因突變檢測(cè)結(jié)果
　　 家系1的先證者EXT1基因檢測(cè)到剪接位點(diǎn)突變c.1883+1G＞A。
　　 家系2的先證者EXT2基因檢測(cè)到剪接位點(diǎn)突變c.1173+1G＞T。

8、>　　 家系3的先證者所有EXT1，EXT2基因的外顯子及其側(cè)翼序列及EXT2基因的5'UTR，3'UTR區(qū)域均未篩查到致病基因突變。
　　 家系4的先證者EXT2基因檢測(cè)到無(wú)義突變c.544C＞T（p.Arg182*）。
　　 2、PCR-RFLP分析結(jié)果
　　 家系1的先證者所檢測(cè)到的突變?cè)谌祟愅蛔償?shù)據(jù)庫(kù)和多發(fā)性軟骨瘤數(shù)據(jù)庫(kù)及PubMed文獻(xiàn)上均未見(jiàn)報(bào)道。在100名無(wú)關(guān)正常人群中進(jìn)行PCR-RFLP分析，均

9、未見(jiàn)到該變異，排除SNP。
　　 3、EXT1和EXT2基因突變的體外mRNA水平分析結(jié)果
　　 家系1的EXT1基因剪接位點(diǎn)突變c.1883+1G＞A的體外剪接分析結(jié)果為六個(gè)隱蔽性剪接位點(diǎn)的激活。其中有四個(gè)位點(diǎn)存在于外顯子9:兩個(gè)導(dǎo)致整碼突變，位于原始剪接位點(diǎn)上游69bp和111bp，分別缺失了23個(gè)（p.Trp606_Lys628del）和37個(gè)氨基酸(p.Tyr592_Lys628del);另外兩個(gè)位點(diǎn)位于原始剪接

10、位點(diǎn)上游161bp和29bp，導(dǎo)致移碼突變，分別產(chǎn)生598個(gè)氨基酸殘基(p.Ile575fs*25)和642個(gè)氨基酸殘基的截短蛋白(p.Ile619fs木25);還有兩個(gè)位點(diǎn)存在于內(nèi)含子9，分別位于原始剪接位點(diǎn)下游201bp和257bp，它們共同的異常剪接效應(yīng)是從628位氨基酸開(kāi)始產(chǎn)生移碼突變，并在629位提前產(chǎn)生終止密碼子(p.Lys628fs*2)。
　　 家系2的EXT2基因剪接位點(diǎn)突變c.1173+1G＞T的體外剪接分析

11、結(jié)果為外顯子7跳躍。由于外顯子7跳躍，產(chǎn)生移碼突變，從360位氨基酸開(kāi)始移碼，編碼了43個(gè)新的氨基酸后提前產(chǎn)生終止密碼子(p.Arg360fs*45)。
　　 4、EXT1基因突變的體內(nèi)mRNA水平分析結(jié)果
　　 家系1 EXT1: c.1883+1G＞A剪接位點(diǎn)突變，體內(nèi)mRNA分析結(jié)果為檢測(cè)到兩個(gè)位于外顯子9的隱蔽性剪接位點(diǎn)的激活，與體外剪接分析中檢測(cè)到的產(chǎn)生整碼突變的兩個(gè)隱蔽性剪接位點(diǎn)相同，沒(méi)有檢測(cè)到體外剪接分析中

12、激活的產(chǎn)生移碼突變的其他四個(gè)隱蔽性剪接位點(diǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 在HME家系中檢測(cè)到新的剪接位點(diǎn)突變EXT1: c.1883+1G＞A，此突變是該中國(guó)漢族HME家系1的致病突變。在中國(guó)漢族HME家系2和4中分別檢測(cè)到EXT2基因已知致病基因突變c.1173+1G＞T和c.544C＞T。對(duì)兩例剪接位點(diǎn)突變進(jìn)行mRNA水平的異常剪接效應(yīng)分析，結(jié)果分別為:EXT1: c.1883+1G＞A激活了隱蔽性剪接位點(diǎn);EXT2: c

13、.1173+1G＞T發(fā)生了外顯子跳躍。
　　 第二部分兩個(gè)中國(guó)漢族骨斑點(diǎn)癥家系的致病基因突變篩查和功能分析
　　 目的：
　　 骨斑點(diǎn)癥（Osteopoikilosis，OPK，OMIM166700）是一種罕見(jiàn)病，是由于骨內(nèi)具有彌漫性斑點(diǎn)狀致密骨質(zhì)而得名。當(dāng)骨斑點(diǎn)癥合并有皮膚改變時(shí)又稱為科斯綜合癥(Buschke-Ollendorff syndrome，BOS，OMIM166700)。該病為常染色體顯性遺傳，其致

14、病基因?yàn)長(zhǎng)EMD3基因。LEMD3基因位于12q12-14.3，全長(zhǎng)79kb，包含13個(gè)外顯子，編碼911個(gè)氨基酸。
　　 LEMD3基因編碼蛋白質(zhì)LEMD3(LAP2-emerin-MAN1domain-containingprotein3)。LEMD3為核膜內(nèi)在蛋白，其羧基末端結(jié)構(gòu)域位于699-911位氨基酸，是SMAD(Sma-and Mad Homologue)結(jié)合位點(diǎn)。LEMD3通過(guò)與SMAD蛋白家族結(jié)合，抑制TGF-

15、β和BMP信號(hào)通路的活性，TGF-β和BMP是影響胚胎期骨骼發(fā)育的兩個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)LEMD3基因突變，失去結(jié)合SMAD的能力，喪失對(duì)TGF-β和BMP信號(hào)途徑的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，致使這兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游基因的表達(dá)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致骨生成增加而引起骨發(fā)育異常的相關(guān)疾病。
　　 迄今為止已經(jīng)報(bào)道了22種與骨斑點(diǎn)癥相關(guān)的LEMD3突變位點(diǎn)，其中包括無(wú)義突變、移碼突變和剪接位點(diǎn)突變。它們的共同特點(diǎn)是由于提前出現(xiàn)終止密碼子而形成截短蛋

16、白，缺乏LEMD3蛋白羧基末端的SMAD結(jié)合區(qū)域，影響其與SMAD的結(jié)合，從而不能正常地調(diào)節(jié)TGF-β和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使骨生成增加，導(dǎo)致骨斑點(diǎn)癥。我們?cè)趦蓚€(gè)骨斑點(diǎn)癥家系中分別篩查到LEMD3基因的一個(gè)剪接位點(diǎn)突變和一個(gè)無(wú)義突變，對(duì)剪接突變所產(chǎn)生的異常剪接效應(yīng)進(jìn)行分析，并且對(duì)兩個(gè)突變所產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)的功能變化進(jìn)行分析和檢測(cè)。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和附屬盛京醫(yī)

17、院收集的來(lái)自中國(guó)遼寧的兩個(gè)骨斑點(diǎn)癥家系，X光片及臨床特征均符合骨斑點(diǎn)癥診斷。在簽署書(shū)面的知情同意書(shū)后，對(duì)兩個(gè)家系中的先證者采集血樣。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 （一）、提取先證者外周血DNA，進(jìn)行致病基因DNA測(cè)序
　　 PCR擴(kuò)增患者致病基因LEMD3所有外顯子及其包含剪接位點(diǎn)的側(cè)翼序列，PCR產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行DNA測(cè)序。
　　 （二）、PCR-RFLP分析
　　 根據(jù)測(cè)序發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)1

18、個(gè)錯(cuò)配引物，產(chǎn)生MspⅠ限制性酶切位點(diǎn)。在100名無(wú)關(guān)正常個(gè)體中進(jìn)行PCR-RFLP驗(yàn)證。
　　 （三）、LEMD3基因突變的體外mRNA水平分析
　　 我們應(yīng)用pcDNA3.1(+)載體，分別構(gòu)建LEMD3基因野生型和剪接位點(diǎn)突變型的MINIGENE，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)后，測(cè)序?qū)Ρ纫吧秃屯蛔冃蚆INIGENE cDNA的改變，體外驗(yàn)證剪接位點(diǎn)突變后所引起的異常剪接效應(yīng)。
　　 （四）、LEMD

19、3基因突變的體內(nèi)mRNA水平分析
　　 從患者新鮮血液樣本中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，RT-PCR擴(kuò)增包括突變點(diǎn)及其上下游外顯子的片段，測(cè)序驗(yàn)證所產(chǎn)生的異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
　　 （五）、LEMD3基因突變的功能研究
　　 1、突變型LEMD3載體的構(gòu)建
　　 以野生型LEMD3質(zhì)粒(pSVK3-Flag-LEMD3-WT)為模板，分別構(gòu)建剪接位點(diǎn)突變和無(wú)義突變的LEMD3突變型載體。
　　 2

20、、Western Blot方法檢測(cè)突變型LEMD3蛋白的變化
　　 將野生型LEMD3質(zhì)粒(pSVK3-Flag-LEMD3-WT)和突變型LEMD3質(zhì)粒（pSVK3-Flag-LEMD3-MTsplice， pSVK3-Flag-LEMD3-MTnonsense）分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，提取總蛋白，Western Blot檢測(cè)突變型相對(duì)于野生型的LEMD3蛋白變化。
　　 3、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)研究突變后的L

21、EMD3對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響
　　 將野生型或突變型LEMD3質(zhì)粒與TGF-β信號(hào)通路的熒光素酶報(bào)告基因載體p3TP-LUX或BMP信號(hào)通路的熒光素酶報(bào)告基因載體pBRE-LUC共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，觀察LEMD3突變后對(duì)以上兩個(gè)信號(hào)通路的影響。
　　 4、免疫共沉淀及Westem Blot方法檢測(cè)LEMD3蛋白與SMAD蛋白的相互作用
　　 將野生型或突變型LEMD3質(zhì)粒與SMAD1或SMAD2全長(zhǎng)的載體共轉(zhuǎn)染

22、HEK293細(xì)胞，應(yīng)用免疫共沉淀方法及Western Blot方法檢測(cè)LEMD3蛋白與SMAD蛋白的相互作用。
　　 結(jié)果：
　　 1、LEMD3基因突變檢測(cè)結(jié)果
　　 家系1的先證者檢測(cè)到剪接位點(diǎn)突變c.2573-2 delA。
　　 家系2的先證者檢測(cè)到無(wú)義突變c.1323 C＞A（p.Tyr441*）。
　　 2、PCR-RFLP分析結(jié)果
　　 家系1的先證者檢測(cè)到的變異在人類突變數(shù)

23、據(jù)庫(kù)和PubMed文獻(xiàn)上均未見(jiàn)報(bào)道。在100名無(wú)關(guān)正常人群中進(jìn)行PCR-RFLP分析，均未發(fā)現(xiàn)該變異，排除SNP。
　　 3、剪接位點(diǎn)突變的體外剪接分析結(jié)果
　　 家系1的剪接位點(diǎn)突變c.2573-2 delA為內(nèi)含子12受體剪接位點(diǎn)的消失，體外剪接分析的結(jié)果顯示:該剪接突變所產(chǎn)生的異常剪接效應(yīng)為內(nèi)含子12保留。由于內(nèi)含子12保留后產(chǎn)生移碼突變效應(yīng)，從858位氨基酸開(kāi)始移碼，在產(chǎn)生16個(gè)新的氨基酸后，在874位提前形成終

24、止密碼子(p.Glu858fs*17)。
　　 4、剪接位點(diǎn)突變的體內(nèi)mRNA分析結(jié)果
　　 體內(nèi)mRNA的剪接驗(yàn)證結(jié)果同樣為內(nèi)含子12保留，與體外剪接分析結(jié)果一致。
　　 5、LEMD3基因突變的功能研究
　　 構(gòu)建了剪接位點(diǎn)突變和無(wú)義突變的LEMD3突變型質(zhì)粒并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，已經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，提取蛋白，應(yīng)用Western Blot檢測(cè)突變后LEMD3蛋白相對(duì)于野生型LEMD3蛋白的變化;雙熒光素

25、酶報(bào)告基因檢測(cè)工作已經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的量及刺激因子重組蛋白TGFβ1和ALK3的加入量及刺激時(shí)間;SMAD蛋白表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功，已經(jīng)分別和野生型及突變型LEMD3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。以上實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖表的結(jié)果正在整理中。
　　 結(jié)論：
　　 在骨斑點(diǎn)癥家系1中篩查到一個(gè)未報(bào)道的突變c.2573-2 delA，該突變?yōu)榧艚油蛔?，mRNA水平分析顯示剪接位點(diǎn)突變所產(chǎn)生的異常剪