遺傳性多發(fā)性外生性骨疣及骨斑點癥的致病基因突變研究.pdf

1、第一部分四個中國漢族遺傳性多發(fā)性外生性骨疣家系的致病基因突變研究
　　 目的：
　　 遺傳性多發(fā)性外生性骨疣(hereditary multiple exostoses，HME)是一種累及軟骨化骨的以骨骼系統(tǒng)多發(fā)性外生性骨疣為特征的疾病，常見于長骨干骺端。HME發(fā)病率在西方人群約1/50，000，為常染色體顯性遺傳病，具有遺傳異質性，目前研究結果顯示該病致病基因主要為EXT1和EXT2基因。
　　 EXT1基因定

2、位于8q24.11-q24.13，全長約250kb，包含11個外顯子，編碼746個氨基酸。EXT2基因定位于11p11-p12，基因長約110kb，包含14個外顯子，編碼718個氨基酸。EXT1基因和EXT2基因分別編碼Exostosin-1蛋白和Exostosin-2蛋白，它們均為Ⅱ型跨膜糖蛋白，定位于內質網，二者均為具有D-葡萄糖醛酸(GlcA)轉移酶活性和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)轉移酶活性的硫酸乙酰肝素聚合酶(HS

3、-Pol)，參與硫酸乙酰肝素的合成。Exostosin-1與Exostosin-2形成異源二聚體，該二聚體相比于二者單獨存在時其糖基轉移酶的活性大大增高。到目前為止，與HME相關的EXT1基因突變已經超過429種，EXT2基因突變已經超過222種，大多數突變是產生移碼的插入突變和缺失突變，無義突變和剪接位點的突變也有所報道。
　　 本文以4個中國漢族HME家系為研究對象，對EXT1和EXT2基因進行DNA測序來篩查突變，通過限制

4、性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP）對突變進行驗證，排除單核苷酸多態(tài)性(Single NucleotidPolymorphism，SNP)。并對所篩查到的剪接位點突變，聯(lián)合應用體外剪接分析工具及體內mRNA水平檢測進行剪接位點突變所導致的異常剪接效應分析。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院和遼寧省人民

5、醫(yī)院收集的4個中國漢族HME家系，臨床表現與HME既往報道相符，臨床診斷明確。在簽署書面的知情同意書后，對家系中4名先證者采集血樣（其中患者4例，男2例、女2例）。
　　 二、方法
　　 1、致病基因EXT1和EXT2的DNA測序
　　 PCR擴增患者EXT1和EXT2基因所有外顯子及包括剪接位點的側翼序列，PCR產物回收純化后進行DNA測序。
　　 2、PCR-RFLP分析
　　 根據測序發(fā)現的

6、突變設計1個錯配引物，引入PmaCⅠ限制性酶切位點。在100名無關正常個體中進行限制性片段長度多態(tài)分析。
　　 3、EXT1和EXT2基因突變的體外mRNA水平分析
　　 我們應用MINIpCAS載體，分別構建EXT1和EXT2基因野生型和剪接位點突變型的MINIGENE轉染HeLa細胞，RT-PCR分析后，測序對比野生型和突變型MINIGENE cDNA的改變，體外驗證剪接位點突變后所引起的異常剪接效應。
　　

7、 4、EXT1基因突變的體內mRNA水平分析
　　 從家系1先證者新鮮血液樣本中提取總RNA，反轉錄成為cDNA，RT-PCR擴增包括突變位點及其上下游外顯子的片段，測序驗證所產生的異常轉錄產物。
　　 實驗結果：
　　 1、基因突變檢測結果
　　 家系1的先證者EXT1基因檢測到剪接位點突變c.1883+1G＞A。
　　 家系2的先證者EXT2基因檢測到剪接位點突變c.1173+1G＞T。

8、>　　 家系3的先證者所有EXT1，EXT2基因的外顯子及其側翼序列及EXT2基因的5'UTR，3'UTR區(qū)域均未篩查到致病基因突變。
　　 家系4的先證者EXT2基因檢測到無義突變c.544C＞T（p.Arg182*）。
　　 2、PCR-RFLP分析結果
　　 家系1的先證者所檢測到的突變在人類突變數據庫和多發(fā)性軟骨瘤數據庫及PubMed文獻上均未見報道。在100名無關正常人群中進行PCR-RFLP分析，均

9、未見到該變異，排除SNP。
　　 3、EXT1和EXT2基因突變的體外mRNA水平分析結果
　　 家系1的EXT1基因剪接位點突變c.1883+1G＞A的體外剪接分析結果為六個隱蔽性剪接位點的激活。其中有四個位點存在于外顯子9:兩個導致整碼突變，位于原始剪接位點上游69bp和111bp，分別缺失了23個（p.Trp606_Lys628del）和37個氨基酸(p.Tyr592_Lys628del);另外兩個位點位于原始剪接

10、位點上游161bp和29bp，導致移碼突變，分別產生598個氨基酸殘基(p.Ile575fs*25)和642個氨基酸殘基的截短蛋白(p.Ile619fs木25);還有兩個位點存在于內含子9，分別位于原始剪接位點下游201bp和257bp，它們共同的異常剪接效應是從628位氨基酸開始產生移碼突變，并在629位提前產生終止密碼子(p.Lys628fs*2)。
　　 家系2的EXT2基因剪接位點突變c.1173+1G＞T的體外剪接分析

11、結果為外顯子7跳躍。由于外顯子7跳躍，產生移碼突變，從360位氨基酸開始移碼，編碼了43個新的氨基酸后提前產生終止密碼子(p.Arg360fs*45)。
　　 4、EXT1基因突變的體內mRNA水平分析結果
　　 家系1 EXT1: c.1883+1G＞A剪接位點突變，體內mRNA分析結果為檢測到兩個位于外顯子9的隱蔽性剪接位點的激活，與體外剪接分析中檢測到的產生整碼突變的兩個隱蔽性剪接位點相同，沒有檢測到體外剪接分析中

12、激活的產生移碼突變的其他四個隱蔽性剪接位點。
　　 結論：
　　 在HME家系中檢測到新的剪接位點突變EXT1: c.1883+1G＞A，此突變是該中國漢族HME家系1的致病突變。在中國漢族HME家系2和4中分別檢測到EXT2基因已知致病基因突變c.1173+1G＞T和c.544C＞T。對兩例剪接位點突變進行mRNA水平的異常剪接效應分析，結果分別為:EXT1: c.1883+1G＞A激活了隱蔽性剪接位點;EXT2: c

13、.1173+1G＞T發(fā)生了外顯子跳躍。
　　 第二部分兩個中國漢族骨斑點癥家系的致病基因突變篩查和功能分析
　　 目的：
　　 骨斑點癥（Osteopoikilosis，OPK，OMIM166700）是一種罕見病，是由于骨內具有彌漫性斑點狀致密骨質而得名。當骨斑點癥合并有皮膚改變時又稱為科斯綜合癥(Buschke-Ollendorff syndrome，BOS，OMIM166700)。該病為常染色體顯性遺傳，其致

14、病基因為LEMD3基因。LEMD3基因位于12q12-14.3，全長79kb，包含13個外顯子，編碼911個氨基酸。
　　 LEMD3基因編碼蛋白質LEMD3(LAP2-emerin-MAN1domain-containingprotein3)。LEMD3為核膜內在蛋白，其羧基末端結構域位于699-911位氨基酸，是SMAD(Sma-and Mad Homologue)結合位點。LEMD3通過與SMAD蛋白家族結合，抑制TGF-

15、β和BMP信號通路的活性，TGF-β和BMP是影響胚胎期骨骼發(fā)育的兩個重要信號轉導途徑。當LEMD3基因突變，失去結合SMAD的能力，喪失對TGF-β和BMP信號途徑的負反饋調節(jié)作用，致使這兩個信號轉導途徑下游基因的表達增強，從而導致骨生成增加而引起骨發(fā)育異常的相關疾病。
　　 迄今為止已經報道了22種與骨斑點癥相關的LEMD3突變位點，其中包括無義突變、移碼突變和剪接位點突變。它們的共同特點是由于提前出現終止密碼子而形成截短蛋

16、白，缺乏LEMD3蛋白羧基末端的SMAD結合區(qū)域，影響其與SMAD的結合，從而不能正常地調節(jié)TGF-β和BMP信號轉導通路，使骨生成增加，導致骨斑點癥。我們在兩個骨斑點癥家系中分別篩查到LEMD3基因的一個剪接位點突變和一個無義突變，對剪接突變所產生的異常剪接效應進行分析，并且對兩個突變所產生的異常蛋白質的功能變化進行分析和檢測。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院和附屬盛京醫(yī)

17、院收集的來自中國遼寧的兩個骨斑點癥家系，X光片及臨床特征均符合骨斑點癥診斷。在簽署書面的知情同意書后，對兩個家系中的先證者采集血樣。
　　 二、實驗方法
　　 （一）、提取先證者外周血DNA，進行致病基因DNA測序
　　 PCR擴增患者致病基因LEMD3所有外顯子及其包含剪接位點的側翼序列，PCR產物回收純化后進行DNA測序。
　　 （二）、PCR-RFLP分析
　　 根據測序發(fā)現的突變位點設計1

18、個錯配引物，產生MspⅠ限制性酶切位點。在100名無關正常個體中進行PCR-RFLP驗證。
　　 （三）、LEMD3基因突變的體外mRNA水平分析
　　 我們應用pcDNA3.1(+)載體，分別構建LEMD3基因野生型和剪接位點突變型的MINIGENE，轉染HeLa細胞，RT-PCR檢測后，測序對比野生型和突變型MINIGENE cDNA的改變，體外驗證剪接位點突變后所引起的異常剪接效應。
　　 （四）、LEMD

19、3基因突變的體內mRNA水平分析
　　 從患者新鮮血液樣本中提取總RNA，反轉錄成為cDNA，RT-PCR擴增包括突變點及其上下游外顯子的片段，測序驗證所產生的異常轉錄產物。
　　 （五）、LEMD3基因突變的功能研究
　　 1、突變型LEMD3載體的構建
　　 以野生型LEMD3質粒(pSVK3-Flag-LEMD3-WT)為模板，分別構建剪接位點突變和無義突變的LEMD3突變型載體。
　　 2

20、、Western Blot方法檢測突變型LEMD3蛋白的變化
　　 將野生型LEMD3質粒(pSVK3-Flag-LEMD3-WT)和突變型LEMD3質粒（pSVK3-Flag-LEMD3-MTsplice， pSVK3-Flag-LEMD3-MTnonsense）分別轉染HEK293細胞，提取總蛋白，Western Blot檢測突變型相對于野生型的LEMD3蛋白變化。
　　 3、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)研究突變后的L

21、EMD3對相關信號通路的影響
　　 將野生型或突變型LEMD3質粒與TGF-β信號通路的熒光素酶報告基因載體p3TP-LUX或BMP信號通路的熒光素酶報告基因載體pBRE-LUC共轉染C2C12細胞，觀察LEMD3突變后對以上兩個信號通路的影響。
　　 4、免疫共沉淀及Westem Blot方法檢測LEMD3蛋白與SMAD蛋白的相互作用
　　 將野生型或突變型LEMD3質粒與SMAD1或SMAD2全長的載體共轉染

22、HEK293細胞，應用免疫共沉淀方法及Western Blot方法檢測LEMD3蛋白與SMAD蛋白的相互作用。
　　 結果：
　　 1、LEMD3基因突變檢測結果
　　 家系1的先證者檢測到剪接位點突變c.2573-2 delA。
　　 家系2的先證者檢測到無義突變c.1323 C＞A（p.Tyr441*）。
　　 2、PCR-RFLP分析結果
　　 家系1的先證者檢測到的變異在人類突變數

23、據庫和PubMed文獻上均未見報道。在100名無關正常人群中進行PCR-RFLP分析，均未發(fā)現該變異，排除SNP。
　　 3、剪接位點突變的體外剪接分析結果
　　 家系1的剪接位點突變c.2573-2 delA為內含子12受體剪接位點的消失，體外剪接分析的結果顯示:該剪接突變所產生的異常剪接效應為內含子12保留。由于內含子12保留后產生移碼突變效應，從858位氨基酸開始移碼，在產生16個新的氨基酸后，在874位提前形成終

24、止密碼子(p.Glu858fs*17)。
　　 4、剪接位點突變的體內mRNA分析結果
　　 體內mRNA的剪接驗證結果同樣為內含子12保留，與體外剪接分析結果一致。
　　 5、LEMD3基因突變的功能研究
　　 構建了剪接位點突變和無義突變的LEMD3突變型質粒并經測序驗證，已經轉染HEK293細胞，提取蛋白，應用Western Blot檢測突變后LEMD3蛋白相對于野生型LEMD3蛋白的變化;雙熒光素

25、酶報告基因檢測工作已經預實驗確定各組質粒轉染的量及刺激因子重組蛋白TGFβ1和ALK3的加入量及刺激時間;SMAD蛋白表達載體經測序驗證構建成功，已經分別和野生型及突變型LEMD3質粒共轉染HEK293細胞，進行免疫共沉淀實驗。以上實驗的實驗數據和圖表的結果正在整理中。
　　 結論：
　　 在骨斑點癥家系1中篩查到一個未報道的突變c.2573-2 delA，該突變?yōu)榧艚油蛔?，mRNA水平分析顯示剪接位點突變所產生的異常剪