食品中常見(jiàn)病原菌快速檢測(cè)系統(tǒng)的研究——自制裸磁珠吸菌性能研究和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)副溶血性弧菌方法的建立.pdf

1、目的：研究自制裸磁珠對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌的吸附性能；建立TaqMan-實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)副溶血性弧菌的方法，用于食物中毒快速診斷和食品中副溶血性弧菌的污染狀況調(diào)查。 方法： 第一部分自制裸磁珠吸菌性能研究 1．磁珠對(duì)低菌量菌液的吸附與濃集的研究 研究磁珠對(duì)低菌量細(xì)菌的吸附性能、溫度對(duì)磁珠吸附性能的影響及磁珠對(duì)樣品中細(xì)菌的吸附性能。 2．磁珠對(duì)高菌量菌液的吸附與濃集的研究 研究高菌量時(shí)磁珠

2、對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的吸附方法、干式和濕式磁珠對(duì)細(xì)菌的吸附性能、不同磁珠用量對(duì)細(xì)菌的吸附、原始菌量對(duì)磁珠吸附容量的影響、不同孵育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的吸附以及不同孵育溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的吸附情況。 第二部分TaqMan-實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)副溶血性弧菌方法的建立 1.引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中副溶血性弧菌tdh基因的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，并提交BLASTN進(jìn)行比對(duì)，探討其代表性。 2.TaqMarr-實(shí)時(shí)熒光P

3、CR檢測(cè) 檢測(cè)菌方法的建立與反應(yīng)條件優(yōu)化建立基于TaqMan-實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)副溶血性弧菌反應(yīng)體系并進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化以及靈敏度、特異性試驗(yàn)。 3.未知菌量菌液濃度測(cè)定 以模板菌濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量測(cè)定未知菌量的副溶血性弧菌。 結(jié)果： 1.自制裸磁珠對(duì)低菌量菌液吸附：37℃對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌和衛(wèi)生指示菌有很強(qiáng)的吸附，吸附率達(dá)到97％。食品成分對(duì)其吸附有一

4、定影響，吸附率最低為58.42％。 2.自制裸磁珠對(duì)高菌量菌液吸附：磁珠用量與吸附率近似正相關(guān)，吸附容量與原始菌量存在對(duì)數(shù)線性相關(guān)。溫度影響吸附效率。吸附作用40min后吸附率無(wú)明顯差異，達(dá)到平衡。此外，干式和濕式保存的磁珠，對(duì)試驗(yàn)細(xì)菌的吸附率無(wú)明顯差異。 3.TaqMan-實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)體系靈敏度高，能達(dá)到1.3×10<'4>cfu/ml(33cfu/PCR反應(yīng)體系)，對(duì)8株攜帶tdh基因的副溶血性弧菌能檢測(cè)到

5、熒光信號(hào)，而對(duì)其它弧菌菌株則檢測(cè)不到熒光信號(hào)，無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好，可用于食物中毒快速診斷和食品中副溶血性弧菌的污染狀況調(diào)查。 結(jié)論： 磁分離技術(shù)不僅能快速吸附和濃集細(xì)菌，而且能同時(shí)吸附多種目的菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)自制裸磁珠對(duì)不同菌量的菌液都有比較理想的吸附。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的快速定量檢測(cè)是其它檢測(cè)方法無(wú)法比擬的，其較低的檢出限、良好的特異性和實(shí)驗(yàn)時(shí)間短是這一技術(shù)的主要特點(diǎn)，用于副溶血性弧菌的快速檢測(cè)靈敏度較高，特異性強(qiáng)，可用