食品中4種病原菌PCR檢測方法的研究.pdf

1、近年來，各地食品安全事件呈爆發(fā)性趨勢，且越演越烈。在這些事件中，食品中病原菌的污染是引起細菌性食物中毒及相關性傳染病的主要因素。為預防和控制此類情況的發(fā)生，除做好常規(guī)的消毒、衛(wèi)生等環(huán)節(jié)外，對食品中病原菌的快速檢測為防治病原菌引起的食物中毒起到重要的意義。常見的食品及其原料中的病原菌包含有：鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌以及銅綠假單胞菌等。使用目前的檢測食品中病原菌的方法，應對當前日趨復雜的多菌混合污染，顯得力不

2、從心。故此，建立起一類快速、敏捷、精確的檢測方法已經(jīng)迫在眉睫。鏈式聚合反應（PCR）中，多重 PCR是在常規(guī)單一 PCR的基礎上，在反應體系中加入多對引物或（和）不同的模板，同時進行擴增，最終得到多個核酸片斷的PCR反應。該方法克服了常規(guī)單一PCR方法由于檢測項目單一，導致的應對多重污染時檢測耗時、繁瑣等一些缺點，可以實現(xiàn)對多種食品中病原菌快速地同步檢測。
　　本文研究了一種針對食品及其原料中的4種病原菌，即金黃色葡萄球菌、志賀氏

3、菌、銅綠假單胞菌及多殺性巴氏桿菌的多重PCR反應的檢測方法。依據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的基因序列，分別設計并合成了用于擴增金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc基因）、志賀氏菌質(zhì)粒侵襲抗原 H基因（ipaH基因）、多殺性巴氏桿菌菌毛蛋白基因（ptfA基因）以及銅綠假單胞菌外膜蛋白L基因（oprL基因）的4對特異性引物。本文以退火溫度為主要因素，先進行單菌PCR擴增的條件優(yōu)化、特異性及敏感性試驗。得知，4對特異性引物分別能擴增出280bp

4、、474bp、150bp和331bp的目的基因片段，對食品中其它的病原菌如鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和致病性大腸桿菌均未擴增出目的片段。4個目的基因PCR反應的最佳退火溫度依次為：55℃、54℃、56℃、56℃。敏感性試驗中，4菌基因組DNA的檢出限依次為：100pg/μL、1pg/μL、1 pg/μL、10pg/μL。此后，進行4菌多重PCR擴增的條件優(yōu)化、特異性及敏感性試驗。結果表明，多重PCR最佳退火溫度為54℃，特