rBTI誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制研究.pdf

1、線粒體是高度動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，其在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)不斷的融合與分裂以保持一定的形態(tài)。線粒體的分裂與融合程度失衡，會(huì)引起線粒體功能障礙，如線粒體膜去極化及ATP合成受抑制等，機(jī)體主要通過(guò)線粒體自噬來(lái)消除這些發(fā)生功能障礙的線粒體。線粒體自噬是自噬機(jī)制對(duì)線粒體的一種選擇性的清除，即損傷的線粒體被包裹在自噬體中，進(jìn)而與溶酶體融合而被降解，以此來(lái)保證細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。線粒體自噬的異常與多種疾病包括神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥等都密切相關(guān)。
　　先前

2、的研究發(fā)現(xiàn)，重組型蕎麥胰蛋白酶抑制劑rBTI(recombination buckwheat trypsin inhibitor)主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬來(lái)抑制細(xì)胞增殖的，但是rBTI誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制還不清楚。近期研究顯示，rBTI作用于肝癌細(xì)胞Hep G2后，線粒體數(shù)量明顯減少，且伴隨有大量自噬泡的產(chǎn)生，由此推測(cè)rBTI誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞發(fā)生的自噬可能為線粒體自噬。
　　為了進(jìn)一步研究rBTI誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞發(fā)生

3、自噬的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用透射電子顯微鏡、MDC染色、Western Blot、質(zhì)粒pEGFP-LC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞及激光共聚焦顯微鏡等方法分析rBTI對(duì)Hep G2細(xì)胞自噬水平的影響；質(zhì)粒pDsRed2-mito轉(zhuǎn)染細(xì)胞、激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)分析rBTI對(duì)線粒體形態(tài)的影響；Western Blot及qRT-PCR技術(shù)分析 rBTI對(duì)線粒體融合與分裂的影響；質(zhì)粒 pEGFP-LC3與 pDsRed2-mito共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞來(lái)分析自噬標(biāo)志

4、蛋白LC3與線粒體的共定位；流式細(xì)胞術(shù)、酶標(biāo)儀、Western Blot等技術(shù)分析rBTI對(duì)Hep G2細(xì)胞線粒體膜電位、ROS及抗氧化系統(tǒng)的影響；流式細(xì)胞術(shù)、pEGFP-LC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞及Western Blot分析ROS和rBTI誘導(dǎo)的自噬的關(guān)系。
　　結(jié)果顯示，rBTI作用于Hep G2細(xì)胞后，包裹有線粒體的自噬體結(jié)構(gòu)明顯增多；細(xì)胞的自噬水平升高；點(diǎn)狀分布的GFP-LC3增多；細(xì)胞自噬相關(guān)分子(LC3, beclin1, AT

5、G5)表達(dá)量升高，自噬底物P62表達(dá)降低，表明rBTI誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞發(fā)生自噬。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，線粒體標(biāo)志分子Tom20和Cox IV表達(dá)水平降低，線粒體發(fā)生片段化，線粒體分裂蛋白Fis1表達(dá)水平升高，而線粒體融蛋白Mfn1表達(dá)水平降低，表明rBTI促進(jìn)線粒體發(fā)生分裂，引起線粒體數(shù)量減少。因此推測(cè)rBTI促進(jìn)自噬機(jī)制對(duì)線粒體的清除。而且發(fā)現(xiàn)，自噬標(biāo)志蛋白LC3與線粒體的共定位現(xiàn)象增強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明rBTI 誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞發(fā)生

6、的自噬屬于線粒體自噬。同時(shí)檢測(cè)到，rBTI引起線粒體膜電位降低，誘導(dǎo)活性氧(ROS)短暫升高，ATP水平降低，表明rBTI引起Hep G2細(xì)胞線粒體發(fā)生功能障礙，這可能是rBTI引起Hep G2細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬的直接原因。而超氧化物歧化酶(SOD)活性，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，還原型谷胱甘肽(GSH)的含量及還原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比例均有升高的趨勢(shì)，表明rBTI增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化能力，這可能是細(xì)胞對(duì)ROS