人巨細胞病毒潛伏感染下細胞的自噬現(xiàn)象.pdf

1、目的：
　　人巨細胞病毒(HCMV)在人群中普遍感染，盡管HCMV在健康個體中的感染通常是無癥狀性感染，但對于存在免疫缺陷的個體，HCMV是導致其患病和死亡的主要原因。HCMV也是目前公認的引起先天性感染最常見病原體，常導致新生兒畸形的發(fā)生。細胞自噬(autophagy)是一種主要由溶酶體介導的降解通路，作為細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種保護性機制，不僅可以通過將長壽命蛋白和衰老細胞器降解為小肽或氨基酸為細胞提供再生資源，而且也可作為宿

2、主防御機制抵抗病原微生物的感染和寄生。近年對HCMV與自噬關(guān)系的研究也取得重要進展，但現(xiàn)有關(guān)于HCMV和自噬之間關(guān)系的研究都是在HCMV增殖感染的細胞上進行的，對于HCMV潛伏感染這種人群中更為普遍的感染模式，目前國內(nèi)外尚無文獻報道其對自噬的影響。明確HCMV潛伏感染時對細胞自噬的影響，這將有助于闡明HCMV潛伏感染的發(fā)病機制，同時為HCMV防治藥物和疫苗的研發(fā)提供新靶標。
　　方法:
　　本研究主要包括兩部分:1）人巨細胞

3、病毒潛伏感染模型的建立:以HCMV感染人胚肺成纖維細胞(Human Embryo Lung Fibroblast，HEF)作為HCMV增殖感染對照組，以未感染的人急性單核白血病細胞（human acute monocytic leukaemia cellline，THP-1）作為空白對照組，用HCMV Towne株分別感染THP-1細胞和HEF細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài);在感染后6h、5d、7d時去培養(yǎng)上清，收集細胞，用DNA抽提試

4、劑盒提取細胞內(nèi)總DNA，熒光定量PCR檢測THP-1細胞內(nèi)HCMV的DNA拷貝數(shù);Trizol法提取細胞總RNA，RT-PCR檢測HCMVIE1、IE2和UL81-82ast基因的表達水平;用RIPA強裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，western-blot檢測HCMVIE蛋白水平。構(gòu)建穩(wěn)定的HCMV潛伏感染模型。
　　2)人巨細胞病毒潛伏感染下細胞的自噬現(xiàn)象:
　　透射電鏡下觀察HCMV Towne株感染THP-1細胞后能

5、否在超微結(jié)構(gòu)水平誘導自噬體的出現(xiàn)，并與空白組進行對比;RT-PCR法定量分析HCMV Towne株感染THP-1細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄水平;western-blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和Atg5的表達水平，并和未感染HCMV Towne株的空白組進行對比分析。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建HCMV潛伏感染模型。熒光定量PCR結(jié)果顯示:每個THP-1細胞內(nèi)HCMVDNA拷貝

6、數(shù)大約在1.5個，在感染后1-5d逐漸增加，5d后逐漸減少;RT-PCR結(jié)果顯示:HEF細胞和THP-1細胞感染HCMV Towne株后均有HCMV即刻早期基因IE和潛伏相關(guān)基因UL81-82astmRNA的表達。HCMV Towne株感染的THP-1細胞，IE2基因mRNA在感染后6h、5d均有表達，7d后基本不表達;IE1基因mRNA表達一直不明顯;UL81-82ast基因mRNA在感染后6h即有表達，并且一直持續(xù)到感染后7d。We

7、stern-blot結(jié)果顯示:在HCMV感染的HEF細胞，HCMV IE蛋白在感染后6h即有表達，感染后5d、7d表達增加。在THP-1細胞，IE蛋白在感染后6h、5d有表達，感染后7d時IE不表達。
　　HCMV Towne株感染THP-1細胞能夠促進細胞的自噬，和空白組THP-1細胞相比，電鏡結(jié)果顯示:Towne株感染THP-1細胞后，與空白組相比，病毒感染后1d就能誘導細胞內(nèi)出現(xiàn)雙成膜結(jié)構(gòu)的自噬體。在感染后5d，細胞漿內(nèi)出現(xiàn)

8、大量自噬體和自噬溶酶體，局部也能見到池狀彎曲的雙成膜結(jié)構(gòu)的自噬前體，以自噬溶酶體居多。感染后9d，細胞內(nèi)仍可見自噬體和自噬溶酶體的存在，但仍以自噬溶酶體為主。相比較之下，空白組細胞漿內(nèi)幾乎沒有自噬相關(guān)囊泡的出現(xiàn)。電子顯微鏡下，隨機選取10個空白組細胞和感染后1d、5d、9d的感染組細胞各10個，在不同的非連續(xù)性區(qū)域計數(shù)細胞內(nèi)自噬相關(guān)囊泡的數(shù)量:空白組細胞約2-3個自噬體或自噬溶酶體;感染后1d的細胞約10-13個;感染后5d的細胞約80

9、個;感染后9d的細胞約30個。與空白組相比，自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄和表達在HCMV感染后明顯增加。促進自噬的強度也存在變化:HCMV感染THP-1細胞5天后，在THP-1細胞上能建立穩(wěn)定的潛伏感染，在潛伏感染期間，HCMV促進細胞自噬的強度較未建立潛伏感染之前減弱，表現(xiàn)為自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄和表達在潛伏期間逐漸減少，但和空白組細胞相比轉(zhuǎn)錄和表達水平仍高。
　　結(jié)論: