褪黑素對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用研究及其機(jī)制初步探討.pdf

1、目的：探討褪黑素(melatonin,Mel)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells,MSCs)增殖分化的作用，以期優(yōu)化MSCs擴(kuò)增及向神經(jīng)元樣細(xì)分化的實(shí)驗(yàn)參數(shù)；研究Mel干預(yù)的MSCs上Mel受體亞型mRNA的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.以密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)方法分離MSCs，以含15％胎牛血清L-DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測CD45、CD44、CD

2、105。 2.取傳至6代的MSCs，加入不同濃度的Mel，MTT法分別檢測24小時(shí)、3天、5天細(xì)胞的增殖情況；免疫細(xì)胞化學(xué)法和PT-PCR法檢測Mel誘導(dǎo)后24h、3天、5天MSCs表面NSE、GFAP的表達(dá)。 3.RT-PCR法測定Mel誘導(dǎo)的第6代MSCs上，Mel受體MT<,1>和MT<,2>mRNA的表達(dá)情況：提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，凝膠電泳，體外基因測序。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度

3、離心法結(jié)合貼壁純化MSCs，建立了穩(wěn)定的MSCs培養(yǎng)增值體系，細(xì)胞成活率高，貼壁良好，可連續(xù)傳15代。該采集方法簡便易行，體外擴(kuò)增容易，細(xì)胞獲得主富，可推薦為MSCs研究的常規(guī)培養(yǎng)方法。 2.在Mel誘導(dǎo)下，MSCs可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞；Mel對(duì)MSCs的增殖無明顯作用。 3.本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR技術(shù)，初步證實(shí)被Mel誘導(dǎo)的MSCs存在MT<,1>受體mRNA的表達(dá)；通過測序，擴(kuò)增所獲得的基因序列與GenBank的人MT