大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠肺氣腫的修復(fù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、COPD是慢性氣道疾病，與有毒顆粒和氣體引起的肺組織異常炎性反應(yīng)有關(guān)，導(dǎo)致氣流受限不完全可逆的肺氣腫。COPD是全世界死亡率的第5位因素，而且COPD的患病率和死亡率有逐年上升的趨勢(shì)。目前對(duì)COPD發(fā)病機(jī)制的觀點(diǎn)是香煙刺激物誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的聚集，炎性細(xì)胞釋放活性氧和蛋白水解酶，引起肺基質(zhì)的毀損和結(jié)構(gòu)細(xì)胞的死亡。最近的研究認(rèn)為肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞的凋亡可能在COPD的發(fā)病機(jī)制中有很重要的作用。對(duì)COPD病人肺組織切片的研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)

2、胞的凋亡增加，而這些結(jié)構(gòu)細(xì)胞的增殖并沒有均衡的增加，因而可促進(jìn)肺組織的毀損和肺氣腫的發(fā)生。而且在嚴(yán)重的COPD動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，在肺氣腫的發(fā)展中顯著缺乏炎性細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明即使沒有炎性細(xì)胞的聚集，肺泡壁細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞凋亡也足夠引起肺氣腫的發(fā)生。越來(lái)越多的證據(jù)證明了炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激與凋亡相互作用導(dǎo)致COPD發(fā)病的復(fù)雜性。因此有待于進(jìn)一步研究在COPD發(fā)病過程中凋亡的途徑，以及進(jìn)一步評(píng)估是否抗凋亡或再生可以成為阻止疾病進(jìn)

3、一步惡化的靶點(diǎn)。在健康肺組織的毀損過程中凋亡和再生失衡現(xiàn)象也提示應(yīng)用干細(xì)胞治療肺氣腫疾病的可能。
　　 最近干細(xì)胞的研究使組織損傷和再生的傳統(tǒng)治療觀點(diǎn)帶來(lái)了新的希望。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)有迅速增殖的潛能，MSCs來(lái)源的細(xì)胞可以分化為間充質(zhì)組織，例如骨、軟骨、肌肉以及非間充質(zhì)組織，如內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞。心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)科在干細(xì)胞的研究中有很大的突破，但是由于呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，呼吸干細(xì)胞的研究

4、發(fā)展很慢。Ortiz報(bào)道了骨髓來(lái)源干細(xì)胞可能減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，第一次提出骨髓來(lái)源的干細(xì)胞對(duì)肺組織疾病具有顯著效果。近年來(lái)關(guān)于干細(xì)胞對(duì)肺損傷的研究逐漸開展起來(lái)，爭(zhēng)議眾多，焦點(diǎn)在于MSCs是否對(duì)損傷肺組織有修復(fù)作用以及分化為哪種類型的肺組織細(xì)胞。
　　 骨髓干細(xì)胞在肺內(nèi)分化能力和作用的報(bào)道各異。Hashimoto移植表達(dá)EGFP的MSC/HSC到博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠，引起大量的GFP陽(yáng)性細(xì)胞遷移到達(dá)纖維變性的損傷區(qū)，

5、提示許多成纖維細(xì)胞來(lái)源于骨髓來(lái)源的前體細(xì)胞。Mauricio Rojas應(yīng)用博來(lái)霉素和白消安處理的肺損傷模型，在GFP-MSCs移植后，發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)GFP陽(yáng)性細(xì)胞可以分化為I型肺泡上皮細(xì)胞、II型肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。但是由于試驗(yàn)方法和技術(shù)的不同，如骨髓干細(xì)胞的提取、肺損傷的方法、移植物在組織中的檢測(cè)方法不同，眾多實(shí)驗(yàn)小組的研究結(jié)果不同，檢測(cè)到HSC/MSC在肺內(nèi)分化為不同類型的細(xì)胞。目前肺損傷后移植干細(xì)胞的量、

6、時(shí)機(jī)以及干細(xì)胞在肺內(nèi)的修復(fù)作用還沒有明確的肯定。
　　 骨髓MSCs不僅具有分化能力還有分泌功能，能夠分泌多種細(xì)胞因子例如白介素-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15以及白血病抑制因子、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、干細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)等。Chen等報(bào)道通過尾靜脈注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞到腦缺血大鼠，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表

7、達(dá)，減少腦缺血部位細(xì)胞的凋亡，改善腦缺血大鼠的腦功能恢復(fù)。Kocher等報(bào)道移植造血干細(xì)胞可改善心肌梗死周邊區(qū)肥大心肌細(xì)胞的凋亡。因此提出干細(xì)胞不僅具有分化作用，也可以通過一些途徑抑制損傷部位細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 MSCs移植對(duì)肺氣腫是否有修復(fù)作用，在肺內(nèi)可以分化為哪種類型的結(jié)構(gòu)細(xì)胞，在肺組織微循環(huán)的作用下分泌哪些細(xì)胞因子，是否也同樣具有抗細(xì)胞凋亡作用，抗凋亡的途徑是什么，目前還鮮見報(bào)道。因此我們應(yīng)用MSCs移植到木瓜蛋白酶和

8、鈷60照射誘導(dǎo)的肺氣腫模型中，探討肺氣腫形成的機(jī)制以及MSCs移植對(duì)肺損傷修復(fù)作用的機(jī)制，為干細(xì)胞治療肺氣腫疾病的可能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化能力的鑒定
　　 目的：建立體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的方法，觀察MSCs的生物學(xué)性狀，為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：取2月齡大鼠骨髓，經(jīng)密度梯度離心后取單個(gè)核細(xì)胞層接種，保留貼壁細(xì)胞傳代，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，測(cè)定

9、生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀進(jìn)行MSCs表型測(cè)定和細(xì)胞周期分析。檢測(cè)細(xì)胞向成骨、成脂細(xì)胞分化情況。
　　 結(jié)果：從大鼠骨髓中培養(yǎng)的MSCs具有體外擴(kuò)增和多向分化潛能。
　　 結(jié)論：建立了體外分離純化MSCs的方法，驗(yàn)證了MSCs體外分化潛能，可作為組織工程種子細(xì)胞的可行性。
　　 第二部分 放射損傷對(duì)于移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在受體大鼠不同器官中植入的影響
　　 目的：探討放射損傷對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移

10、植后在受體大鼠不同器官中植入的影響以及可能的機(jī)制。
　　 方法：采用TUNEL法檢測(cè)正常對(duì)照組和單純放射組大鼠心臟、腎臟、肝臟、肺臟的細(xì)胞凋亡率。應(yīng)用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法提取雄性大鼠骨髓MSCs，培養(yǎng)后把MSCs移植到60COγ照射和未經(jīng)照射的雌性大鼠體內(nèi)，通過PCR和Y染色體熒光原位雜交(Y-FISH)示蹤雄性大鼠MSCs在雌性大鼠體內(nèi)的分布情況。
　　 結(jié)果：照射后大鼠心臟、腎臟、肝臟、肺臟細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照

11、組。PCR結(jié)果顯示照射后移植MSCs的大鼠心臟、腎臟、肝臟、肺臟和外周血中可以擴(kuò)增出Sry基因的DNA序列，而且Y-FISH顯示照射后移植MSCs的大鼠在心臟、腎臟、肝臟、肺臟中可發(fā)現(xiàn)Y染色體陽(yáng)性的細(xì)胞。但是未經(jīng)照射行MSCs移植的大鼠在上述器官中未發(fā)現(xiàn)Y染色體陽(yáng)性的細(xì)胞。
　　 結(jié)論：全身放射促進(jìn)組織細(xì)胞的凋亡，并導(dǎo)致移植的MSCs在受體大鼠心臟、腎臟、肝臟和肺臟的植入。
　　 第三部分 肺泡壁細(xì)胞的凋亡參與木瓜蛋白酶

12、所致大鼠肺氣腫的形成
　　 目的：觀察木瓜蛋白酶所致的肺氣腫大鼠肺泡壁細(xì)胞凋亡，探討細(xì)胞凋亡在肺氣腫發(fā)病中的作用。
　　 方法：大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組，木瓜蛋白酶組，木瓜蛋白酶和鈷60處理組。觀察肺組織病理學(xué)變化，TUNEL法檢測(cè)大鼠肺泡壁凋亡細(xì)胞，免疫組化法檢測(cè)肺泡壁細(xì)胞PCNA、Bax和SP-C蛋白的表達(dá)。TUNEL與SP-C免疫熒光法鑒定凋亡細(xì)胞中的II型肺泡上皮細(xì)胞。
　　 結(jié)果：木瓜蛋白酶組、木瓜

13、蛋白酶和鈷60處理組大鼠出現(xiàn)明顯肺氣腫改變。木瓜蛋白酶和鈷60處理組平均內(nèi)襯間隔、平均肺泡面積和單位面積肺泡數(shù)與木瓜蛋白酶組比較有顯著性差異。木瓜蛋白酶組、木瓜蛋白酶和鈷60處理組大鼠肺泡壁細(xì)胞的AI、PI以及Bax染色陽(yáng)性的細(xì)胞百分比顯著高于正常對(duì)照組；而SP-C染色陽(yáng)性的細(xì)胞百分比顯著低于正常對(duì)照組。木瓜蛋白酶和鈷60處理組大鼠的AI、PI、Bax染色陽(yáng)性的細(xì)胞百分比顯著高于木瓜蛋白酶組；而SP-C染色陽(yáng)性的細(xì)胞百分比顯著低于木瓜蛋

14、白酶組。肺氣腫改變組中一些TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)II型肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志SP-C。
　　 結(jié)論：大鼠肺泡壁細(xì)胞特別是II型肺泡上皮細(xì)胞凋亡參與肺氣腫的形成，Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致肺氣腫大鼠肺泡壁細(xì)胞的凋亡的原因之一。
　　 第四部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植改善木瓜蛋白酶和鈷60照射所致的大鼠肺氣腫改變
　　 目的：觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)木瓜蛋白酶和鈷60照射所致的肺氣腫大鼠肺泡壁細(xì)胞的凋亡以及Bcl-

15、2、Bax蛋白表達(dá)的影響，骨髓MSCs移植后在受體肺組織中的植入和分化情況，探討骨髓MSCs移植改善木瓜蛋白酶和鈷60照射所致肺氣腫的機(jī)制。
　　 方法：雌性大鼠隨機(jī)平均分為三組：正常對(duì)照組、肺氣腫組、肺氣腫+MSCs移植組。利用木瓜蛋白酶氣管內(nèi)滴入和鈷60照射誘導(dǎo)雌性大鼠肺氣腫模型的建立，然后將培養(yǎng)的雄性大鼠MSCs經(jīng)尾靜脈注射到雌性肺氣腫大鼠。觀察移植28d后肺組織形態(tài)學(xué)變化，采用TUNEL法檢測(cè)肺泡壁細(xì)胞的凋亡，免疫組化法

16、檢測(cè)Bcl-2蛋白、Bax蛋白在肺泡壁細(xì)胞中的表達(dá)。通過PCR和Y染色體熒光原位雜交(Y-FISH)示蹤雄性大鼠MSCs在雌性肺氣腫大鼠肺組織內(nèi)的植入情況；用Y-FISH和肺泡表面活性物質(zhì)蛋白C(SP-C)免疫熒光顯色方法檢測(cè)雄性大鼠MSCs在受體肺組織內(nèi)是否分化為II型肺泡上皮細(xì)胞。
　　 結(jié)果：肺氣腫組、肺氣腫+MSCs移植組大鼠出現(xiàn)肺氣腫改變，但肺氣腫+MSCs移植組大鼠肺組織的肺氣腫改變較肺氣腫組減輕；肺氣腫組平均內(nèi)襯間

17、隔、平均肺泡面積和單位面積肺泡數(shù)與肺氣腫+MSCs移植組比較有顯著性差異；TUNEL結(jié)果顯示肺泡壁細(xì)胞凋亡指數(shù)在肺氣腫組和肺氣腫+MSCs移植組大鼠明顯高于正常對(duì)照組，肺氣腫+MSCs移植組肺泡壁細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于肺氣腫組(P<0.01)；免疫組化結(jié)果顯示肺氣腫+MSCs移植組Bcl-2染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比高于肺氣腫組(P<0.01)，肺氣腫+MSCs移植組Bax染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯低于肺氣腫組 (P<0.01)，肺氣腫+MSCs移植

18、組Bcl-2/Bax比值高于肺氣腫組。PCR結(jié)果顯示肺氣腫+MSCs移植組的大鼠肺臟基因組DNA中可以擴(kuò)增出位于Y染色體的Sry基因片斷；Y-FISH顯示肺氣腫+MSCs移植組的雌性大鼠肺組織中有Y染色體陽(yáng)性的細(xì)胞；Y-FISH和SP-C熒光免疫組化結(jié)果顯示肺氣腫+MSCs移植組的雌性大鼠肺組織中的部分Y染色體陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)SP-C。
　　 結(jié)論：骨髓MSCs移植能夠減輕木瓜蛋白酶和鈷60照射所致肺氣腫改變，可能與骨髓MSCs