低強(qiáng)度脈沖超聲促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、組織工程的核心是運(yùn)用工程科學(xué)與生命科學(xué)的原理和技術(shù),研究與開發(fā)具有生命力且與機(jī)體病損組織或器官形態(tài)和功能相一致的生物體,以期恢復(fù)、維持和改善相關(guān)組織或器官形態(tài)和功能的一門新興學(xué)科。迄今,國內(nèi)外組織工程研究已取得令人矚目的研究成果,展現(xiàn)了修復(fù)與重建外科應(yīng)用的美好前景。
　　 組織工程化組織或器官能否構(gòu)建成功,種子細(xì)胞的選擇、處理和應(yīng)用成為了組織工程技術(shù)中需要解決的關(guān)鍵問題,無論采用何種種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化組織或器官都需要大量的種

2、子細(xì)胞。種子細(xì)胞的擴(kuò)增要求提高擴(kuò)增效率,短時(shí)間內(nèi)獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞,因此組織工程對擴(kuò)增種子細(xì)胞的技術(shù)手段要求較高。種子細(xì)胞的數(shù)量不足成為了組織工程產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的制約因素。針對此問題,主要的解決手段及其不足有:(1)生長因子的應(yīng)用:致基因突變的危險(xiǎn)性大,量效關(guān)系不清；(2)改善種子細(xì)胞培養(yǎng)體系:存在諸多技術(shù)上的缺陷,難以完全模擬體內(nèi)微環(huán)境,且費(fèi)用昂貴；(3)轉(zhuǎn)基因技術(shù):轉(zhuǎn)染效率低,體內(nèi)表達(dá)時(shí)間短。上述擴(kuò)增種子細(xì)胞的方法都存在各自的弊端及不完

3、善之處,因此越來越多的學(xué)者都在尋求一種更為有效的技術(shù)手段。
　　 低強(qiáng)度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)的發(fā)射方式為脈沖式,且劑量可低至30mw/cm2以下,對人體組織不會有損傷。目前,LIPUS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨與軟組織創(chuàng)傷的愈合,使用安全,效果顯著。近年來隨著對LIPUS諸多研究的展開,LIPUS在其他領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越受到重視,特別是其在細(xì)胞生物學(xué)方面的重要作用,能促進(jìn)體

4、外成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。而現(xiàn)在種子細(xì)胞應(yīng)用的較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,由此,本課題將LIPUS和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)結(jié)合起來,探索能否找到體外擴(kuò)增組織工程的種子細(xì)胞的新途徑。
　　 目的：
　　 1.觀察LIPUS在不同培養(yǎng)條件下(正常干細(xì)胞培養(yǎng)體系和低血清培養(yǎng)體系)對BMSCs增殖的影響,探討LIPUS在組織工程中擴(kuò)增種子細(xì)

5、胞的可行性。
　　 2.探索LIPUS影響B(tài)MSCs增殖的機(jī)制,為LIPUS促進(jìn)BMSCs的增殖提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.為篩選后續(xù)研究的最佳細(xì)胞接種密度,將第三代BMSCs以3×103個(gè)/ml,5×103個(gè)/ml,1×104個(gè)/ml,5×104個(gè)/ml四種密度各接種于16塊6孔板中,2ml/孔,每板1、2、3號孔為超聲照射組(LIPUS組),4、5、6號孔為空白對照組。采用100mw功率的脈沖超聲

6、照射,脈沖寬度為800ms,脈沖間歇為200ms,超聲照射組每天每孔照射20min。每天鏡下觀察細(xì)胞生長情況,于照射前、照射后1d、3d、5d行MTT檢測。
　　 2.(1)將正常干細(xì)胞培養(yǎng)體系下的第三代BMSCs以篩選出的最佳的觀察密度--1×104個(gè)/ml密度接種于16塊6孔板中(2ml/孔),隨機(jī)分為LIPUS組和空白對照組,每組8個(gè)板,照射方案及檢測方法同前；(2)將第三代BMSCs接種于一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),并分為LIP

7、US組、空白對照組,每天每瓶照射20min,并于照射前、照射后1d、2d、3d、4d、5d、6d、8d、10d行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。
　　 3.(1)采用胎牛血清含量為5ml/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)第三代的BMSCs,將大部份BMSCs的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期狀態(tài)；(2)將所培養(yǎng)的BMSCs以1×104個(gè)/ml接種于16塊6孔板中,隨機(jī)分為LIPUS組和空白對照組,每組8個(gè)板,照射方案及檢測方法同前:(3)將低血清培養(yǎng)條件下

8、的BMSCs接種于一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),并分為LIPUS組、空白對照組,照射方案同前,并于照射前,照射后1d、3d、5d行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。
　　 4.將正常干細(xì)胞培養(yǎng)體系下和低血清培養(yǎng)體系下培養(yǎng)的第三代BMSCs接種于一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),分組及照射方案同前,并于照射前、照射后1d、3d、5d、7d行RT-PCR檢測各組細(xì)胞Bmi-1基因mRNA的表達(dá)指數(shù)；并同時(shí)檢測原代BMSCs的Bmi-1基因mRNA的表達(dá)。

9、　　 結(jié)果：
　　 1.形態(tài)學(xué)觀察示:各密度組細(xì)胞均呈長梭形,多角形,折光性強(qiáng)。3×103組:照射前、照射后各天鏡下觀察LIPUS組和空白對照組的細(xì)胞均散在分布,集落稀疏,觀察兩組細(xì)胞生長情況無明顯差異；5×103組:鏡下觀察LIPUS組于照射1d后細(xì)胞即形成簇狀增生灶,而空白對照組細(xì)胞仍呈單個(gè)散在生長,照射3d、5d后鏡下觀察LIPUS組和空白對照組細(xì)胞均呈簇狀生長,但LIPUS組細(xì)胞集落更為密集；1×104組:LIPUS組

10、于照射后各天細(xì)胞分裂增殖較空白對照組活躍,細(xì)胞增多呈漩渦狀緊密排列,細(xì)胞集落密集；5×104組:鏡下觀察LIPUS組于照射后1d、3d細(xì)胞分裂增殖較空白對照組活躍,細(xì)胞集落密集,照射5d后兩組細(xì)胞集落密集程度相似。MTT檢測示:3×103組:LIPUS組和空白對照組細(xì)胞增殖活性在各檢測時(shí)間比較均無差異性,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；5×103組:LIPUS組和空白對照組細(xì)胞增殖活性在0d、5d比較無差異性(P>0.05),1d、3d

11、LIPUS組細(xì)胞增殖活性高于空白對照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1×104組:LIPUS組于照射后各檢測時(shí)間細(xì)胞增殖活性明顯高于空白對照組(P<0.05)；5×104組:細(xì)胞生長較快,MTT檢測兩組細(xì)胞增殖活性無明顯差異性(P>0.05)。觀察各密度組細(xì)胞增殖活性曲線,1×104組BMSCs增殖曲線較穩(wěn)定,故定為后續(xù)研究的最佳鋪板密度。
　　 2.形態(tài)學(xué)觀察:LIPUS組于照射后各天細(xì)胞分裂增殖較空白對照組明顯活躍,細(xì)胞集

12、落更為密集；MTT檢測表現(xiàn)為:LIPUS組于照射后1d、3d、5d的細(xì)胞增殖活性均明顯高于空白對照組(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期顯示:LIPUS組于照射后各天的細(xì)胞增殖率(S+G2％)均明顯高于空白對照組(P<0.05)；LIPUS組的細(xì)胞增殖率最高可高出空白對照組113.2％,最低為21.1％,LIPUS組增殖率平均要高出空白對照組40.9％。
　　 3.形態(tài)學(xué)觀察顯示:兩組細(xì)胞形態(tài)寬大、扁平,透光性增強(qiáng),LIPU

13、S組于照射后細(xì)胞生長較空白對照組活躍,覆蓋板底面積較空白對照組大；MTT顯示LIPUS組于照射后在各檢測時(shí)間細(xì)胞增殖活性明顯高于空白對照組(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測示:LIPUS組于照射后1d、3d、5d細(xì)胞增殖率顯著高于空白對照組(P<0.05)
　　 4.在不同培養(yǎng)體系下,LIPUS組Bmi-1基因mRNA表達(dá)均高于空白對照組(P<0.05)；正常培養(yǎng)條件下LIPUS組Bmi-1基因mRNA表達(dá)明顯高于低血清培養(yǎng)狀態(tài)下

14、LIPUS組和原代BMSCs(P<0.05),低血清培養(yǎng)狀態(tài)下LIPUS組的Bmi-1基因mRNA表達(dá)亦高于原代BMSCs(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.細(xì)胞接種密度為1×104個(gè)/ml更便于長時(shí)間的研究和觀察。
　　 2.提示LIPUS對BMSCs增殖具有促進(jìn)作用,并能有效地促進(jìn)靜止期的BMSCs進(jìn)入分裂期。
　　 3.LIPUS對低血清培養(yǎng)體系下的BMSCs的增殖也具有顯著的促進(jìn)作用。