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文檔簡介
1、目的:采用脂質(zhì)體法將含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的MmiR3407-MR03重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived stroma cells,BMSCs)得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP基因的BMSCs系,再用睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)定向誘導(dǎo)分化,以探討EGFP基因標(biāo)記對兔
2、 BMSCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞等生物學(xué)特性的影響,以期為BMSCs的體內(nèi)移植提供有效的示蹤方法。
方法:選用新生新西蘭白兔,取其骨髓用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng),通過傳代將 BMSCs擴(kuò)增純化。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測兔 BMSCs的CD34、CD44、CD54抗體的表達(dá)情況。按照高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA。確定G418的最佳篩選濃度后選取第3-5代兔BMSCs,采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)
3、行轉(zhuǎn)染,并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 EGFP基因的兔BMSCs,并觀察細(xì)胞生長情況。取第3-5代的EGFP-BMSCs和第3-5代的BMSCs,分為四組:EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組。EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組均先用10ng/mlbFGF預(yù)誘導(dǎo)24h,再用10ng/mlCNTF誘導(dǎo)12h;EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組均無特殊處理
4、。觀察四組細(xì)胞形態(tài)變化,采用MTT法檢測四組細(xì)胞活性,采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測四組細(xì)胞的巢蛋白(nestin)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NES)的表達(dá)情況,并比較兩誘導(dǎo)組之間、兩空白組之間及各細(xì)胞誘導(dǎo)前后組之間細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞活力及神經(jīng)元特異性標(biāo)記物陽性細(xì)胞率。
結(jié)果:
1.原代兔BMSCs貼壁生長,多呈紡錘形,漩渦樣生長。傳代后細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致,以梭形為主,胞體飽滿,排列更加有序。傳至10代,細(xì)胞逐漸老化。
5、> 2.免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果顯示所培養(yǎng)細(xì)胞的CD44, CD54呈陽性表達(dá),而CD34表達(dá)呈陰性,符合BMSCs的免疫表型特點(diǎn)。
3.脂質(zhì)體介導(dǎo)含 EGFP基因的MmiR3407-MR03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BMSCs后,轉(zhuǎn)染12 h,熒光顯微鏡下可觀察到少量細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,轉(zhuǎn)染48h時(shí)轉(zhuǎn)染率最高,近30%,之后72h內(nèi)隨時(shí)間變化不大。經(jīng)G418篩選后可得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的BMSCs系。
4.CN TF誘導(dǎo)12 h后,可
6、見細(xì)胞胞體伸出2個(gè)或多個(gè)細(xì)長突起,折光性強(qiáng),類似神經(jīng)元形態(tài),熒光顯微鏡下仍可見明亮的綠色熒光。MTT法結(jié)果顯示:24h、48h和72h BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組、BMSCs空白組的OD值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
5.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組的NSE陽性細(xì)胞率、nestin陽性細(xì)胞率分別為(49.98?3.07)%、(48.74?1.32)%;
7、BMSCs誘導(dǎo)組的NSE陽性細(xì)胞率、nestin陽性細(xì)胞率分別為(48.44?3.97)%、(47.86?1.68)%;EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組的NSE、nestin陽性細(xì)胞率均較小。EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs空白組兩組間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0
8、.05);EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組兩組間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:
1.通過脂質(zhì)體法可得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs系,EGFP基因標(biāo)記可能為BMSCs移植提供一種有效的示蹤方法;
2.EGFP基因標(biāo)記的兔BMSCs可誘導(dǎo)分化分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,其生物學(xué)特性無影響;
3.睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)后穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs可定向分化為神經(jīng)
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