生殖支原體MG427重組蛋白的表達(dá)、純化及抗氧化功能的初步研究.pdf

1、目的:表達(dá)生殖支原體(Mycoplasma genitalium, Mg)MG427重組蛋白,并研究其是否具有過氧化物酶活性,以進(jìn)一步探索Mg在宿主內(nèi)持續(xù)感染的可能機(jī)制。
　　方法:通過登錄GenBank獲取Mg的mg427基因序列,用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,以Mg標(biāo)準(zhǔn)株G37 DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增mg427基因;經(jīng)雙酶切后將mg427克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1以構(gòu)建

2、重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/mg427;經(jīng)測(cè)序鑒定后,定點(diǎn)誘導(dǎo)該基因中第289~291位核苷酸TGA密碼子突變?yōu)門GG;將突變后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21,并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白MG427,SDS-PAGE和Western blotting分析和鑒定表達(dá)結(jié)果,GST親和層析柱純化重組蛋白,采用PreScission Protease將重組蛋白GST標(biāo)簽切除后經(jīng)Millipore Amicon Ultra-4離心超濾濃縮

3、,用BCA法測(cè)定表達(dá)的重組蛋白濃度;將純化的MG427蛋白進(jìn)行氧化鐵二甲酚橙實(shí)驗(yàn)(FOX)、DTT氧化實(shí)驗(yàn)以探討其酶活性。
　　結(jié)果:PCR擴(kuò)增出約426 bp的目的基因;構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定其中插入的目的基因序列,經(jīng) BLAST比對(duì)與 GenBank上登錄的Mg-G37的mg427基因序列完全一致。通過PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變,mg427中的TGA被成功突變?yōu)門GG。經(jīng)SDS-PAGE分析,在IPTG誘導(dǎo)下,在表

4、達(dá)菌中表達(dá)出相對(duì)分子量(Mr)約為41.1 KDa的重組目的蛋白,該目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以可溶性形式存在。用 GST親和層析柱成功純化出該重組蛋白,Westernblotting結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白為GST融合蛋白。采用PreScission Protease成功將重組蛋白(rMG427)上GST標(biāo)簽切除。FOX實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:MG427具有過氧化物酶活性,能在一定程度上降解H2O2,且不同濃度的MG427降解H2O2的速度不同;