糞腸球菌Ace重組蛋白的表達(dá)、純化及黏附活性研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含糞腸球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)ace基因的重組載體，在大腸桿菌M15中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行免疫活性分析，研究Ace蛋白在E.faecalis對(duì)膠原蛋白及HeLa細(xì)胞黏附過程中的作用，為探索Ace蛋白生物學(xué)功能及研發(fā)快速診斷試劑盒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：用Premier Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件分析E.faecalis的ace基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以E

2、.faecalis標(biāo)準(zhǔn)株E.faecalis JH2-2為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增ace基因，將其亞克隆入原核表達(dá)載體pQE30中, 構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30/Ace，然后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌M15中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析和鑒定表達(dá)結(jié)果，Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，BCA法測(cè)定純化蛋白濃度。將純化的Ace重組蛋白（rAce）免疫新西蘭兔，用所得抗體對(duì)rAce的免疫活性進(jìn)行分析。用

3、熒光素FITC標(biāo)記E.faecalis JH2-2進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)及黏附抑制實(shí)驗(yàn)，免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增得到大小約930bp的目的片斷；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明其中插入片段為ace目的基因，測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組工程菌表達(dá)了一相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為37kDa的目的蛋白條帶，目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以可溶性蛋白形式存在；

4、經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得了較高純度的重組蛋白；Western-blot檢測(cè)其能與6×His單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。利用純化的rAce免疫新西蘭兔，間接ELISA法測(cè)定兔免疫血清特異性抗體效價(jià)在1:16 000以上；從E.faecalis 細(xì)胞壁提取的Ace蛋白能與rAce免疫兔抗血清識(shí)別。黏附實(shí)驗(yàn)顯示E.faecalis JH2-2 能夠黏附于膠原蛋白Ⅰ及HeLa細(xì)胞表面；黏附抑制試驗(yàn)顯示rAce多克隆抗體具有抑制46℃培養(yǎng)的E.f

5、aecalis JH2-2對(duì)膠原蛋白Ⅰ及HeLa細(xì)胞的黏附作用，這種抑制作用隨著血清稀釋度的增加而減弱。 結(jié)論： 1. 成功構(gòu)建了pQE30/Ace原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化至E.coliM15后表達(dá)出了一相對(duì)分子量（Mr）約為37kDa的重組蛋白； 2. Ace重組蛋白具有較好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體，并具有良好的免疫反應(yīng)性，有望應(yīng)用于E.faecalis快速診斷中； 3. Ace是