鸚鵡熱嗜衣原體CPAF重組蛋白在診斷中的應用研究.pdf

1、目的:從鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophila psittaci,C.psittaci,Cps)中篩選出CpsCPAF序列,分析挑選其免疫優(yōu)勢表位,進行體外克隆表達與純化。用該重組蛋白建立血清學診斷方法,評價其在Cps感染血清學早期診斷中的應用。期望篩選出能應用于Cps抗體檢測的抗原,豐富Cps感染血清學診斷的候選抗原庫,為建立Cps感染的快速診斷奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:應用分子生物學技術(shù),選擇Cps6BC株的CPAF蛋白免

2、疫優(yōu)勢區(qū)基因,進行構(gòu)建 pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒,并用 IPTG誘導其蛋白表達,結(jié)果用SDS-PAGE蛋白電泳和Western blot鑒定;重組蛋白以GST瓊脂糖凝膠FF進行純化,以純化的重組蛋白作為包被抗原,建立其血清學診斷的間接ELISA法;重組蛋白的免疫反應性以Western blot和間接ELISA方法分析;用純化的重組蛋白免疫新西蘭兔,以鑒定重組蛋白的免疫原性。并同時用已有的ELISA試劑盒與建立的間接ELISA

3、方法檢測Cps感染血清標本,比較他們的敏感性與特異性,以便該重組蛋白在Cps感染診斷中的應用價值進行評估。
　　結(jié)果:在線分析 CPAF基因,篩選出目的基因片段(586~1351bp位堿基,共765bp),并擴增出CPAF基因目的片段;經(jīng)酶切和測序鑒定證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒插入序列正確。經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳與Western blot分析,證實重組菌所表達的蛋白為CPAF蛋白,大小約為54 kDa,且目的蛋白為包涵體。包涵體經(jīng)復性

4、純化后,純度在95﹪以上。經(jīng)Western blot分析鑒定,能特異性的結(jié)合CpsCPAF陽性血清,具有良好的反應原性。將純化的CPAF重組蛋白免疫新西蘭兔,證實該重組蛋白具有良好的免疫原性,且兔免疫血清特異性抗體效價大于1:8000。自建的間接ELISA法以純化的CPAF重組蛋白為診斷抗原,與Cps參考血清反應,符合率均為100﹪。與肺炎嗜衣原體(C. pneumoniae,Cpn),沙眼衣原體(C. trachomatis,Ct)無

5、交叉反應。對180份病鴨血清標本進行檢測,與商品 Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA試劑盒比較。自建的ELISA法符合率均為100﹪, Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA Kit符合率為77.5~95﹪。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒,在E.coli BL21中誘導表達出分子量為54kDa的CPAFm重組蛋白;