內毒素誘導急性肺損傷中熱休克蛋白的表達及大黃對HSP70表達的調控.pdf

1、急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）是臨床常見的危急重癥，其病理特征是中性粒細胞在肺內聚集、血管內凝血、肺毛細血管通透性增加致肺水腫，從而導致低氧血癥甚至死亡。
　　 熱休克蛋白（heat shock protein.HSP）是一種應激蛋白（sress protein.SP），同時它也是一種內源性的保護物質，其中HSP70為最保守、最主要的一類，在大多數生物中含量最多，在細胞應激后生成最為顯著。另外，研究表明大黃對LPS誘導的ALI具

2、有保護作用，可以抑制一氧化氮生成和iNOS活性，并且可以降低PLA2（磷脂酶A2）和血小板活化因子（PAF）的活性，從而起到保護肺臟，減輕肺損傷LPS誘導的ALI的作用。
　　 大黃對肺臟的保護作用是否與HSP家族成員有關，即大黃是否通過誘導肺內HSP70的表達水平來保護肺組織，目前國內外尚未見報道，而且HSP70表達水平在LPS誘導的ALI的動物模型中的時間規(guī)律性尚且不清。本實驗應用免疫組織化學染色技術和蛋白印跡試驗等技術進行

3、研究大黃，并對大黃預防組和大黃治療組LPS誘導的肺損傷組織中HSP70的表達部位及表達水平進行對比，從而證實大黃對LPS誘導的ALI的保護機制可能與HSP70有關，并為臨床上應用大黃治療急性肺損傷提供理論依據。
　　 材料和方法：
　　 動物模型的建立及分組：健康wistar大鼠60只，隨機分成對照組、ALI組、大黃預防組、大黃治療組4組，每組15只。麻醉后，頸內靜脈給0.9％生理鹽水或給LPS，于不同時間，腹主動脈取血

4、做血氣分析，后脫頸椎處死動物，并取雙側肺臟標本，進行肺系數測定，而后進行HE染色及免疫組織化學染色（SP 法）以及Western-Blotting測定蛋白表達水平。
　　 結果判定：免疫組織化學陽性物質表達在胞漿或胞核中，陽性判定應用陽性細胞計數：顯微鏡×400倍率下每張切片中隨機選擇10個高倍視野，計算其中陽性細胞數和總細胞數，求出百分比。蛋白印跡結果進行條帶灰度測定。陽性細胞百分比、蛋白印跡灰度值、血氣分析結果和肺系數等數據

5、資料均以均數±標準差（x士s）表示，組內不同時間比較均采用t檢驗。
　　 實驗結果：
　　 1、血氣分析（PO2）
　　 對照組各時間段無明顯差異，LPS組較對照組下降，以1h、2h為明顯。預防用藥組對LPS誘導的肺損傷大鼠的PO2改善較明顯。
　　 2、肺系數
　　 損傷組大鼠肺系數增高，與對照組存在顯著性差異，預防用藥組和治療用藥組肺系數低于損傷組，存在顯著性差異。
　　 3、大體標本

6、和HE染色結果
　　 LPS組肺組織可見斑片狀壞死，整個肺充血、肺間質水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔內彌漫性出血及散在支氣管內出血，預防用藥及治療用藥組肺表面充血有明顯減輕，斑片狀壞死消失，以預防用藥組為明顯。LPS組肺泡腔內可見大量紅細胞和中性粒細胞浸潤，血管及支氣管周圍組織疏松水腫，有較多炎細胞浸潤，以中性粒細胞為主，晚期可見散在透明膜形成。預防用藥組和治療用藥組肺臟的組織病理學有明顯改善，但仍可見較明顯的炎細胞浸潤。
　

7、　 4、HSP70免疫組織化學染色結果
　　 正常組HSP70主要分布于支氣管及細支氣管上皮細胞，肺泡細胞和巨噬細胞可見散在陽性著色。LPS組表達增多，可見散在巨噬細胞和浸潤的中性粒細胞陽性著色，肺泡上皮細胞陽性數輕度增加，陽性細胞率與對照組相比存在顯著性差異。預防用藥組與治療用藥組陽性細胞數增加。
　　 5、蛋白質印跡分析（western-bloting方法）
　　 HSP70條帶位于70KD附近，HSP70

8、蛋白量顯示，預防用藥組和治療用藥組表達量較對照組和LPS組加深、加寬。并且預防用藥組與治療用藥組之間存在顯著性差異（P<0.01）。
　　 討論：
　　 急性肺損傷病理特征是中性粒細胞在肺內聚集，血管內凝血，肺毛細血管通透性增加致肺水腫，從而導致低氧血癥。LPS還可以增加由其介導的各種生物活性因子的生物效應，加重肺臟損傷和臨床癥狀。熱休克蛋白可以提高細胞的應激能力，抵御各種損害因素的影響，起到保護細胞的作用，從而降低動物

9、的死亡率。本實驗研究中預防用藥組HSP70表達增加，免疫組織化學陽性細胞率和Western結果均高于急性肺損傷組，而且大鼠動脈血氧分壓增高、肺系數降低、肺組織損傷的病理學改變較輕，治療用藥組雖有一定程度的改善，但在動脈血氧分壓增高、肺系數降低、肺組織損傷的病理學改變和HSP70表達量上較預防用藥組差。揭示細胞經大黃預處理后細胞中HSP70合成增加，同時也表明了大黃可能通過誘導HSP70的表達增加來保護損傷的肺組織。本研究的實驗結果對臨床

10、上應用大黃注射液的治療的時間上具有指導性意義。
　　 結論
　　 本實驗研究表明，LPS組肺臟損傷較明顯，在預防用藥組可見明顯的肺臟功能的改善，治療用藥組也可見HSP70表達較LPS組增高，并且HSP70在支氣管、細支氣管粘膜上皮和血管內皮均有強陽性表達，說明了HSP70很可能參與了降低血管通透性和保證氣管的正常通氣。本實驗的研究結果表明在注射LPS之前預先給予大黃注射液可以增加肺組織中HSP70的表達量，具有明顯的肺臟