抗炎抗凝雙效融合蛋白TAP-SSL5對血小板功能的影響.pdf

1、研究背景及目的：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是血管壁在受到氧化脂質(zhì)或感染等各種因素損傷的基礎上，發(fā)生的慢性炎癥反應。而炎癥反應與凝血系統(tǒng)激活在動脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用。重組融合蛋白TAP-SSL5是將能夠特異性地與粒細胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)相結合，并能顯著抑制粒細胞在含P-選擇素(

2、P-selectin)表面黏附的蛋白質(zhì)SSL5(staphylococcal superantigen-like protein-5，金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5)作為引導兼功能分子，與能夠抑制凝血因子Xa(factorXa，F(xiàn)Xa)活性的分子—蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide，TAP)進行融合而制備出的具有抗炎抗凝雙效功能的融合蛋白。本課題組的前期研究表明，SSL5還能與血小板表面GPIbα結合，本課

3、題進一步研究了融合蛋白TAP-SSL5對血小板功能的影響，旨在較全面地評價融合蛋白TAP-SSL5的功能。而OS-1是GPIbα的一種拮抗性多肽，能夠抑制vWF-A1與GPIbα-Fc的結合，從而抑制血小板在激活血管內(nèi)皮表面的黏附；本研究還進一步采用OS-1為對照，分析TAP-SSL5對體內(nèi)血栓形成的影響。
　　 研究方法：
　　 1、構建融合蛋白TAP-SSL5表達載體：按本課題組前期已建立的方法，進行TAP-SSL5

4、表達載體的轉(zhuǎn)染以及該融合蛋白的純化。
　　 2、體外實驗部分：靜脈血采自至少兩周之內(nèi)未服用過任何藥物的健康志愿者，用枸櫞酸鈉(與全血的體積比為1:9)抗凝；進行離心后得到富含血小板的血漿(platelet-rich plasma，PRP)，以1×Tyrode’緩沖液平衡CL-2B瓊脂糖凝膠柱后，將PRP以該凝膠柱過濾，得到凝膠過濾的血小板(gel-filtered platelets，GFP)。用流式細胞儀(FACS)檢測融合蛋

5、白TAP-SSL5和血小板結合的情況，并檢測TAP-SSL5和OS-1對小鼠抗人GPIbα單克隆抗體(HIP1)與血小板結合的競爭性抑制作用；用流式細胞儀檢測血小板表面CD62P的表達和PAC-1的結合量，以觀察TAP-SSL5和OS-1對血小板的激活作用；采用Chrono-Log血小板聚集儀檢測融合蛋白TAP-SSL5對全血(或PRP)血小板聚集的影響；并觀察融合蛋白TAP-SSL5對血小板在纖維蛋白原表面靜態(tài)黏附的影響。采用JC-1

6、試劑盒和FACS檢查，進一步研究了OS-1對血小板線粒體膜電位的影響，以期闡明OS-1對血小板功能影響的機制。
　　 3、動物實驗部分：選取昆明小鼠，檢測TAP-SSL5對小鼠尾部出血時間的影響。經(jīng)尾靜脈一次性注射不同劑量的TAP-SSL5，在距離小鼠尾尖5mm處截斷，浸入溫生理鹽水中，記錄出血時間；采用氯化鐵誘導的大鼠下腔靜脈血栓形成模型，研究OS-1的抗血栓形成作用。
　　 結果：
　　 1、融合蛋白TAP-

7、SSL5可與血小板結合，并能競爭性抑制HIP1與血小板的結合，提示TAP-SSL5可與血小板表面的GPIba結合；終濃度為30mg/L的TAP-SSL5能激活血小板，使人血小板表面CD62P的表達和PAC-1的結合量明顯增加，其陽性率分別為90.4%(p<0.001)和66.3%(p<0.01)；終濃度為10mg/L、30mg/L的TAP-SSL5均可引起血小板的顯著聚集；30 mg/L TAP-SSL5可促進血小板在纖維蛋白原表面的靜

8、態(tài)黏附；OS-1可抑制HIP1與血小板的結合；30μM OS-1可激活血小板，使人血小板表面CD62P的表達增加(陽性率39%)和PAC-1的結合量上升(陽性率40.5%)；而OS-1對血小板線粒體膜電位無明顯影響。
　　 2、單次尾靜脈注射10mg/kg的TAP-SSL5，能夠顯著延長小鼠尾部出血時間，由對照組的(647.1±33.7)s延長至(753.6±127.3)s(p<0.01)，而常規(guī)劑量組(3mg/kgTAP-SS

9、L5)尾部出血時間為(612.8±79.1)s，與對照組相比無顯著差異(p>0.05)。采用氯化鐵誘導的大鼠下腔靜脈血栓形成模型的研究結果顯示，DMSO溶劑對照組的血栓重量為(17.3±5.6)mg，單次靜脈注射1.22 mg/kg或3.66mg/kg的OS-1，可顯著抑制FeCl3誘導的大鼠下腔靜脈的血栓形成，血栓重量分別為(10.5±3.5)mg(與對照組相比，p<0.05)和(8.2±4.l)mg(與對照組相比，p<0.01)。<

10、br>　　 結論：
　　 融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5與血小板GPIbα結合的功能，這提示TAP-SSL5可能通過抑制GPIbα與vWF的相互作用，而進一步增強其抗血栓作用；但TAP-SSL5與GPIbα的結合也可導致其在高濃度情況下激活血小板和延長出血時間。OS-1作為GPIbα的拮抗性多肽，可抑制氯化鐵誘導的大鼠下腔靜脈血栓形成，但同時對血小板也有一定的激活效應；體外研究顯示，OS-1對血小板線粒體膜電位無明顯影