蛋白酶體在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的作用及分子病理機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　腹主動(dòng)脈瘤（AAA）是老齡化社會(huì)的常見病，并且隨著人群平均年齡日趨增加，AAA的發(fā)病率漸呈增高趨勢。AAA危害巨大，一旦破裂致大出血，則死亡率達(dá)60～80％，造成生命及財(cái)產(chǎn)的巨大損失。炎癥（淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的浸潤活化）、膠原及彈力纖維的破壞、平滑肌細(xì)胞(SMC)數(shù)量質(zhì)量、和動(dòng)脈壁新生血管的形成等均是AAA發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是調(diào)節(jié)動(dòng)脈壁炎癥及SMC功能的內(nèi)在分子機(jī)制仍不完全清楚。近年來，許多研究提示，泛素蛋白

2、酶體系統(tǒng)，特別是蛋白酶體的活性變化在細(xì)胞炎癥因子的釋放及細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象中起著關(guān)鍵作用。蛋白酶體是負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的主要“構(gòu)件”，一種能夠水解多聚泛素化蛋白的功能復(fù)合體。蛋白酶體活性變化多能夠參與到調(diào)控炎癥反應(yīng)、影響SMC的凋亡等機(jī)制中。蛋白酶體活性的專門抑制劑硼替佐米(Bortezomib，BTZ)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性影響炎癥細(xì)胞及SMC的功能變化，但是蛋白酶體在調(diào)節(jié)AAA形成相關(guān)的病理機(jī)制的作用，尚未見報(bào)道。因此，

3、本研究擬在人及動(dòng)物模型的主動(dòng)脈組織中檢測動(dòng)脈壁內(nèi)蛋白酶體活性變化，通過BTZ抑制主動(dòng)脈內(nèi)蛋白酶體活性，探討蛋白酶體在AAA形成過程中參與炎癥及SMC表型變化的相關(guān)作用及分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　(1)收集人AAA病變及對照動(dòng)脈組織;(2)通過對雄性缺陷小鼠(ApoE-/-)皮下埋植血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)緩釋泵（1，000 ng/min/kg）的方法，復(fù)制動(dòng)物AAA模型;藥物處理則進(jìn)行腹腔注射BTZ（50μg/kg，每

4、周2次），因此小鼠分成四組:Control，BTZ，AngⅡ，AngⅡ+BTZ。采用免疫染色、PCR分析的方法分析動(dòng)脈組織內(nèi)蛋白酶體各亞基表達(dá)水平(包括β1、β2、β5、β1i、β2i、β5i)，通過試劑盒測定蛋白酶體各蛋白酶活性（包括半胱天冬氨酸酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶3種酶活性）;通過測量血管超聲、鼠尾監(jiān)測血壓及大體解剖觀察各組小鼠體內(nèi)動(dòng)脈大體形態(tài)及血壓變化;通過HE染色、VVG染色和免疫組織化學(xué)染色法觀察各組小鼠組織結(jié)構(gòu)的變化和炎癥

5、細(xì)胞浸潤（包括巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞）;通過PCR分析、免疫組織染色分析各組小鼠動(dòng)脈壁內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平(包括TNF-α，IFN-γ，IL-4，IL-6和MCP-1);通過免疫熒光染色αSMA與TUNEL或pCNA共染色確定主動(dòng)脈壁內(nèi)SMC的凋亡或增值狀態(tài)，通過PCR分析、免疫組織染色和Westernblot方法分析各組小鼠動(dòng)脈壁內(nèi)SMC表型標(biāo)識(shí)物表達(dá)水平及心肌素(myocardin)明確調(diào)控SMC表型的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:<

6、br>　　1.人AAA標(biāo)本中蛋白酶體亞基表達(dá)水平及活性均增加;
　　2.AngⅡ刺激誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠建立成功誘導(dǎo)建立AAA動(dòng)物模型，檢測動(dòng)脈內(nèi)蛋白酶體表達(dá)及活性情況，隨著疾病進(jìn)展，蛋白酶體亞基表達(dá)水平及活性均增;
　　3.BTZ抑制蛋白酶體活性后顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠AAA形成（發(fā)生率及直徑）;
　　4.蛋白酶體抑制后抑制AngⅡ誘導(dǎo)的①動(dòng)脈壁內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)及活性;②血管重塑及彈力纖維降解;③血管壁內(nèi)

7、炎癥;
　　5.蛋白酶體抑制后抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管壁內(nèi)SMC增殖但并不影響其凋亡;
　　6.蛋白酶體抑制后逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)動(dòng)脈壁內(nèi)SMC表型轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論:
　　我們證明了蛋白酶體的活化在促進(jìn)體內(nèi)AAA形成了關(guān)鍵的作用。其發(fā)揮作用與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞浸潤，MMP活性增加，及SMC表型轉(zhuǎn)化相關(guān)。低劑量的蛋白酶體抑制劑BTZ有效抑制這些改變。這些發(fā)現(xiàn)，明確了蛋白酶體參與AAA發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制，也使得B