沉默Bmi-1基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞BGC823衰老和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、背景和目的
　　 原癌基因Bmi-1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site1，Bmi-1)屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子Polycomb家族，人類Bmi-1基因定位于10p11.23，由10個(gè)外顯子組成，cDNA全長3568bp，位于640～1620bp之間的開放閱讀框編碼一個(gè)含326個(gè)氨基酸，相對分子量為45kD的核蛋白質(zhì)。序列同源性對比顯示，人和小鼠的Bmi-1在DNA

2、水平和氨基酸水平上同源性分別為86％和98％。Bmi-1蛋白有氨基端環(huán)指結(jié)構(gòu)和中心區(qū)H-T-H結(jié)構(gòu)域，這對細(xì)胞復(fù)制壽命的延長和對抑制p16INK4a是必須的。實(shí)驗(yàn)證實(shí)INK4a/ARF位點(diǎn)是Bmi-1基因的下游調(diào)控位點(diǎn)，直接受Bmi-1的負(fù)調(diào)控而影響細(xì)胞增殖和衰老。當(dāng)Bmi-1高表達(dá)時(shí)，p16 INK4a表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)cyclinD與CDK4/6形成復(fù)合物，通過p16 INK4a/cyclin D/Rb通路，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；Bmi

3、-1高表達(dá)還抑制p19ARF，通過p19ARF/MDM2/p53通路，阻止細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤中存在Bmi-1基因的高表達(dá)，Bmi-1高表達(dá)提示預(yù)后不良。研究表明Bmi-1是通過作用于INK4a/ARF基因位點(diǎn)而影響細(xì)胞增殖及衰老的，并且，Bmi-1基因的表達(dá)水平還與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬利用RNA干擾技術(shù)，沉默胃癌BGC823細(xì)胞Bmi-1基因的表達(dá)，觀察這種沉默對胃癌BGC823細(xì)胞衰老和轉(zhuǎn)移

4、的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 根據(jù)RNA干擾目標(biāo)序列的選取原則，利用Dharmacon公司提供的RNA干擾設(shè)計(jì)軟件siDESIGN Center，(http：//www.dharmacon.com/designcenter/designcenterpage.aspx)對Bmi-1序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。經(jīng)過BLAST同源性分析，確定RNA干擾靶序列。合成2對Bmi-1基因靶向RNA干擾序列的DNA單鏈，退火成雙鏈發(fā)卡樣DNA；利

5、用BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，將其重組入RNA干擾載體pRNAT-U6.2；利用pRNAT-U6.2的插入鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選得到重組子pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356；對重組子的插入序列進(jìn)行DNA序列測定，并與設(shè)計(jì)序列做同源性比較。利用脂質(zhì)體LipofectAmineTM2000包裹，將pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356轉(zhuǎn)入人胃癌BGC823細(xì)胞中，同時(shí)

6、設(shè)立空載體對照組(轉(zhuǎn)染空載體pRNAT-U6-2的胃癌BGC823細(xì)胞)和空白對照組(未轉(zhuǎn)染人胃癌BGC823細(xì)胞)；RT-PCR和Western-Blot方法檢測各組細(xì)胞Bmi-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平；細(xì)胞衰老染色和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測沉默BGC823細(xì)胞Bmi-1表達(dá)對細(xì)胞衰老和對細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.進(jìn)過篩選優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定B-cell specific moloney l

7、eukemia virus insertion site1，Bmi-1(NM_005180)1104-1122位(GGAGGAGGTGAATGATAAA)、1356-1364位(GAGAGATGGACTGACAAAT)為Bmi-1 RNA干擾的靶序列。
　　 2.PCR擴(kuò)增篩選得到重組子pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356，測序分析其插入序列與設(shè)計(jì)的RNA干擾發(fā)卡樣DNA序列完全一致。
　

8、　 3.實(shí)驗(yàn)1組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.2-si1104的胃癌BGC823細(xì)胞)、實(shí)驗(yàn)2組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.2-si1356的胃癌BGC823細(xì)胞)細(xì)胞Bmi-1 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.062±0.009和0.114±0.013；空載體對照組和空白對照組細(xì)胞Bmi-1mRNA的相對表達(dá)量分別為0.314±0.041和0.321±0.038。實(shí)驗(yàn)1、2組細(xì)胞Bmi-1 mRNA的相對表達(dá)量與2個(gè)對照組相比，Bmi-1 mR

9、NA的相對表達(dá)量顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性(P<0.05)。
　　 4.未轉(zhuǎn)染的胃癌BGC823細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pRNAT-U6.2的細(xì)胞中Bmi-1蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)；而轉(zhuǎn)染靶向Bmi-1(pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356)的實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞中，Bmi-1蛋白表達(dá)被顯著抑制，其中轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.2-si1104的胃癌BGC823細(xì)胞中Bmi-1蛋白表達(dá)幾乎完全被抑制。
　　

10、5.實(shí)驗(yàn)1、2組的平均細(xì)胞衰老率分別為28.3％±3.9％和25.9％±4.3％，空載體對照組和空白對照組的平均細(xì)胞衰老率分別為15.6％±2.7％和17.2％±3.1％；實(shí)驗(yàn)1、2組與2個(gè)對照組相比平均細(xì)胞衰老率顯著增加，差異有非常顯著性(P<0.01)。
　　 6.實(shí)驗(yàn)1、2組穿透Matrigel的平均細(xì)胞數(shù)分別為22.4±4.2和33.6±5.5；空載體對照組和空白對照組分別為74.7±9.3和68.9±10.1。實(shí)驗(yàn)1、

11、2組與2個(gè)對照組相比，穿透Matrigel的平均細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有顯著性(P<0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.Bmi-1(NM_005180)1104-1122位(GGAGGAGGTGAATGATAAA)、1356-1364位(GAGAGATGGACTGACAAAT)為RNA干擾的靶序列，構(gòu)建的RNA干擾載體pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356，轉(zhuǎn)染人胃癌BGC823細(xì)胞能顯著降