MACC1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞株BGC-823基因表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景:
　　 胃癌是消化系統(tǒng)常見腫瘤，在世界范圍，胃癌死亡率居世界第二位，雖然在發(fā)達(dá)國家，近年胃癌發(fā)病率有所下降，但在我國，根據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)資料，我國城市胃癌的死亡率居惡性腫瘤死亡率的第三位，在農(nóng)村，胃癌的死亡率甚至居于第一位。外科手術(shù)仍是其主要的治療方法，但僅有30-50％的患者可獲得根治性切除，雖然目前針對胃癌的藥物及治療方法較多，但療效并不滿意，究其原因，胃癌的早期轉(zhuǎn)移是死亡率高的重要原因，故而研究胃癌早期轉(zhuǎn)移的機(jī)制及其

2、標(biāo)志物就顯得尤為重要了。
　　 2009年stein等人報(bào)道了MACC1(Metastasis-associated in colon cancer1)基因在腸癌中的可能作用，他們研究發(fā)現(xiàn)MACC1的表達(dá)水平與生存率明顯相關(guān)，低表達(dá)的患者5年生存率為80％，而高表達(dá)者其5年生存率僅有15％。發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的MACC1mRNA水平明顯高于未轉(zhuǎn)移患者(p＜0.0001)，Logistic和Cox回歸分析表明，MACC1可以作為腸癌轉(zhuǎn)

3、移的預(yù)后指標(biāo)。繼而出現(xiàn)大量的研究報(bào)道MACC1不僅在腸癌,而且與肝細(xì)胞癌、肺癌、胃癌等實(shí)體腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。其中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在MACC1基因在發(fā)生血管轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，Shimokawa H等人收集了146例Ⅰ期肺腺癌術(shù)后標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)MACC1的表達(dá)水平與預(yù)后密切相關(guān)。而在胃癌中，目前有文獻(xiàn)報(bào)道MACC1基因的表達(dá)與其腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)。這些均表明MACC1在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)方面具有重要的指導(dǎo)作用，極有可能作為一個(gè)腫瘤預(yù)后的分子標(biāo)志物

4、。但是在胃癌方面的作用仍不深入，需進(jìn)一步的探討研究。
　　 研究MACC1基因功能，需要大量的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，所以構(gòu)建合適的MACC1表達(dá)載體是研究其結(jié)構(gòu)功能的必要基礎(chǔ)。目前國內(nèi)尚未見構(gòu)建胃癌MACC1表達(dá)載體的相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用293FT細(xì)胞為模板，成功擴(kuò)增出MACC1全長cDNA序列及MACC1表達(dá)的干擾片段，構(gòu)建過表達(dá)載體及干擾表達(dá)載體，為研究該基因在多種類型腫瘤中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌中MACC1基因

5、與其腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)，為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，我們首次成功建立了穩(wěn)定表達(dá)MACC1的胃癌pBaBb-MACC1/BGC-823細(xì)胞株及其MACC1基因沉默表達(dá)的細(xì)胞株sh-MACC1/BGC-823，并對MACC1的表達(dá)情況通過RT-PCR及Western blot進(jìn)行驗(yàn)證分析，為探討MACC1在胃癌中的作用機(jī)制提供了可靠保證。
　　 基因芯片又稱DNA微陣列（DNA microarray），該技術(shù)是指將大量探針分子固定于支持物上

6、，將樣品分子標(biāo)記，然后將兩者進(jìn)行雜交，利用相關(guān)軟件收集雜交信號，從而獲取樣品分子的數(shù)量和基因信息。通過不同的探針序列的設(shè)計(jì)、不同的分析方法使得該技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值也各有不同，如基因表達(dá)譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。
　　 隨著20世紀(jì)80年代人類基因組計(jì)劃的開展，結(jié)構(gòu)基因組學(xué)已經(jīng)得到了充分的認(rèn)識，而功能基因組學(xué)方面仍存在太多的未知領(lǐng)域，基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)給功能基因組的研究提供了一個(gè)全新的平臺?；虮磉_(dá)譜芯

7、片目前應(yīng)用比較廣泛，技術(shù)比較成熟，它可以檢測整個(gè)基因組的各個(gè)基因mRNA的變化水平。傳統(tǒng)的研究方法僅僅局限于某個(gè)或某幾個(gè)基因和他們之間簡單的調(diào)控關(guān)系，無法全面的認(rèn)識和研究腫瘤整個(gè)發(fā)生過程中基因復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。而基因芯片恰恰能解決傳統(tǒng)研究方法的不足之處，其以大規(guī)模高通量的方法研究成千上萬的基因在不同狀態(tài)下的表達(dá)，預(yù)測他們的功能，預(yù)測他們之間的復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系。從基因水平研究腫瘤相關(guān)基因的變化，通過基因芯片技術(shù)篩選和檢測腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)

8、移過程中的差異表達(dá)基因，不但可以從病理狀態(tài)中尋找可能病因，也為早期的診斷及預(yù)后提供依據(jù)，基因芯片技術(shù)和臨床的相互結(jié)合將為成為未來研究發(fā)展的一個(gè)必然趨勢。胃癌的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移是多種因素的相互之間的作用、多個(gè)基因表達(dá)異常的結(jié)果，其具體分子機(jī)制至今仍未能闡明。這就需要基因芯片技術(shù)幫助我們對其進(jìn)一步的研究。
　　 本研究中我們通過基因轉(zhuǎn)載技術(shù)，構(gòu)建了MACC1過表達(dá)（pBaBb-MACC1/BGC-823）及沉默（sh-MACC1/BGC

9、-823）紐胞株，然后利用基因芯片技術(shù)對這兩個(gè)細(xì)胞株進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)MACC1的改變引起細(xì)胞株基因的廣泛改變，其中LHX9、PDK3及PLEKHA5與MACC1的表達(dá)趨勢完全一致，IL8、MYO1A及OST-β則與MACC1的表達(dá)趨勢完全相反，進(jìn)而通過文獻(xiàn)查閱，希望找到與MACC1相互調(diào)控的關(guān)系或與胃癌早期轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為下一步的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.通過基因轉(zhuǎn)載技術(shù)建立穩(wěn)定過表達(dá)MACC1基因

10、的胃癌細(xì)胞株pBaBb-MACC1/BGC-823及穩(wěn)定抑制其表達(dá)的細(xì)胞株sh-MACC1/BGC-823;
　　 2.利用基因芯片研究 MACC1表達(dá)改變的細(xì)胞株pBaBb-MACC1/BGC-823, sh-MACC1/BGC-823及正常細(xì)胞株BGC-823之間的基因表達(dá)譜差異;
　　 3.尋找與MACC1表達(dá)趨勢一致及相反的差異表達(dá)基因，探討MACC1與差異表達(dá)基因之間可能存在的細(xì)胞信號通路或各方面調(diào)節(jié)機(jī)制的聯(lián)系

11、。
　　 方法:
　　 1.以人胚腎293FT細(xì)胞為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲全長MACC1 cDNA序列，將目的基因序列及干擾目的基因的片段序列克隆入pBaBb-puro及pSUPERretro-puro表達(dá)載體，建立pBaBb-puro-MACC1過表達(dá)載體和pSUPERretro-puro-MACC1抑制MACC1基因表達(dá)的載體。經(jīng)過酶切鑒定、測序并觀察轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞報(bào)告基因表達(dá)情況從而判斷是否構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的兩

12、個(gè)載體分別轉(zhuǎn)染入人胃痛BGC-823細(xì)胞，感染結(jié)束后48h加入puromycin（0.5μg/ml）篩選陽性克隆，然后在培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增培養(yǎng)并傳代建系。收集細(xì)胞的RNA，進(jìn)行熒光定量PCR及Western blot檢測MACC1在這些細(xì)胞中表達(dá)情況，并采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，通過單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各組之間差異以鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　 2.委托上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿苫蛐酒ぷ?，采用N

13、imbleGen表達(dá)譜芯片對MACC1基因轉(zhuǎn)染前后的胃癌細(xì)胞株BGC-823的基因進(jìn)行研究，該芯片包括45033個(gè)基因。分別提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用NimbleGen進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)而用NimbleGen雜交系統(tǒng)進(jìn)行雜交和NimbleGen緩沖液試劑盒洗滌，芯片結(jié)果采用Axon Genepox4000B掃描儀進(jìn)行掃描，通過NimbleScan軟件讀取數(shù)據(jù)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化等分析后輸入Agilent GeneSpringGX軟件進(jìn)一步

14、分析。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為ratio≥2，為避免實(shí)驗(yàn)誤差，每個(gè)細(xì)胞株各重復(fù)3次。
　　 3.通過分析找出在pBaBb-MACC1/BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)、sh-MACC1/BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)及在pBaBb-MACC1/BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)、sh-MACC1/BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)的基因，利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，并采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，通過單因素方差分析(one-wayAN

15、OVA)比較各組之間差異篩選出相關(guān)基因。通過文獻(xiàn)的查閱，試圖尋找與MACC1的相關(guān)性，為胃癌的早期轉(zhuǎn)移研究提供依據(jù)。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功擴(kuò)增全長的MACC1cDNA及干擾片段，經(jīng)測序鑒定完全正確;轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞可見清晰的綠色熒光表達(dá)，順利構(gòu)建了MACC1過表達(dá)及沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株，通過qRT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)pBaBb-MACC1/BGC-823、sh-MACC1/BGC-823穩(wěn)定細(xì)

16、胞株構(gòu)建成功。
　　 2.對過表達(dá)、沉默及正常的胃癌細(xì)胞株BGC-823進(jìn)行基因表達(dá)譜分析后發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)及下調(diào)基因多達(dá)數(shù)千種，這些差異表達(dá)基因的功能涉及多個(gè)方面，包括與細(xì)胞凋亡及周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生進(jìn)展相關(guān)、酶活性基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及翻譯活性調(diào)控等多個(gè)方面，找出在pBaBb-MACC1/BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)、sh-MACC1/BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)及在pBaBb-MACC1/BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)、s

17、h-MACC1/BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)的基因LHX9、PDK3、PLEKHA5、IL8、MYO1A及OST-β六個(gè)基因，并對其進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證并和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與基因芯片結(jié)果一致。
　　 3.查閱文獻(xiàn)資料，對LHX9、PDK3、PLEKHA5、IL8、MYO1A及OST-β基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)、功能等方面的研究分析，找出可能與MACC1的相關(guān)性或與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為胃癌早期轉(zhuǎn)移的進(jìn)一步研究提供方向。
　　 結(jié)論

18、:
　　 1.我們成功建立了MACC1基因轉(zhuǎn)染及抑制其表達(dá)的細(xì)胞株pBaBb-MACC1/BGC-823及sh-MACC1/BGC-823，通過驗(yàn)證表明其穩(wěn)定表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異。
　　 2.應(yīng)用基因芯片技術(shù)對3個(gè)細(xì)胞株差異基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)MACC1基因的改變引起pBaBb-MACC1/BGC-823及sh-MACC1/BGC-823細(xì)胞株廣泛的基因改變，找出與MACC1表達(dá)趨勢一致及相反的6個(gè)基因，并對這些

19、基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果提示與基因芯片結(jié)果一致。
　　 3.MACC1基因轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC-823后引起的胃癌細(xì)胞基因表達(dá)譜廣泛改變，這些基因的功能涉及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期調(diào)控、蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄等多個(gè)方面。
　　 4.對差異基因的分析發(fā)現(xiàn)MACC1基因引起胃癌細(xì)胞基因表達(dá)譜中一些非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上分子的改變，其中與MACC1表達(dá)趨勢完全一致和相反的基因可能與胃癌的發(fā)展轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，但是與M