白藜蘆醇對胃癌BGC-823細胞中凋亡相關(guān)基因PDCD5表達影響的研究.pdf

1、背景和目的:胃癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一,目前胃癌已成為中國內(nèi)地第三大常見腫瘤,嚴重威脅人民的健康和生命,是我國重點研究的惡性腫瘤之一。人程序化死亡分子5(the human programmed cell death5,PDCD5)基因是由北京大學人類疾病基因研究中心1999年在國際上首先報道的一個人類新基因,是從人白血病細胞株TF-1細胞中克隆到的凋亡相關(guān)新基因(GeneBank登記號AF014955)。PDCD5定位于19

2、q12-q13.1,參與細胞凋亡過程的調(diào)控。PDCD5的mRNA在50余種人類組織中均有表達,并不限定于造血系統(tǒng),其中在成年心、睪丸、腎、腎上腺及胎盤中高表達,其中胚胎組織表達明顯低于成年組織,國內(nèi)外已有多家實驗室利用不同技術(shù)發(fā)現(xiàn)PDCD5在疾病情況下,特別是在腫瘤、自身免疫性疾病和局部損傷的情況下表達明顯下降。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等藥用植物中的一種多酚類化合物,作為低毒的天然藥物,對消

3、化、呼吸、血液、生殖等多個系統(tǒng)來源的腫瘤細胞有抑制作用,可顯著抑制多種人類腫瘤細胞的生長、誘導腫瘤細胞凋亡。研究表明它可以通過抗氧化、抑制環(huán)氧化酶(COX)、抑制細胞色素P450酶、誘導腫瘤細胞分化和促進腫瘤細胞凋亡等來發(fā)揮抗癌作用。
　　為探討白藜蘆醇對人胃低分化腺癌BGC-823細胞中PDCD5蛋白和mRNA表達的影響以及白藜蘆醇對BGC-823細胞生長的抑制作用,本研究采用免疫細胞化學SP法檢測PDCD5在BGC-823細胞

4、中的蛋白表達;采用原位雜交技術(shù)檢測BGC-823細胞中PDCD5在mRNA水平上的表達;采用流式細胞術(shù)和TUNEL法檢測BGC-823細胞的增殖與凋亡。探討PDCD5在BGC-823細胞中的表達與BGC-823細胞凋亡的相關(guān)性,為胃癌的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　材料和方法:1.標本:人胃低分化腺癌細胞BGC-823購自中科院上海細胞生物學研究所,經(jīng)復蘇孵育,傳代分為不同的實驗組,分別用25μmol/L、50μmol/L、100μ

5、mol/L、200μmol/L的白藜蘆醇處理BGC-823細胞24h、48h、72h。并設(shè)空白對照組(培養(yǎng)液對照組),溶劑對照組(DMSO對照組),順鉑組(3μg/ml),聯(lián)合用藥組(白藜蘆醇200μmol/L+順鉑3μg/ml)。2.應用免疫細胞化學SP法檢測各組BGC-823細胞中PDCD5蛋白表達。3.應用原位雜交技術(shù)檢測各組BGC-823細胞中PDCD5 mRNA表達。4.應用流式細胞技術(shù)檢測各組分別作用24h、48h、72h細

6、胞的增殖分化情況。5.應用流式細胞技術(shù)檢測各組分別作用24h、48h、72h細胞的凋亡情況。6.應用TUNEL法檢測各組作用24h細胞凋亡的情況。7.采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差(±S)表示,兩組均數(shù)的比較用t檢驗(t-test);兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA);以α=0.05為顯著性檢驗標準。
　　結(jié)果:1.免疫細胞化學結(jié)果:PDCD5蛋白在人胃低分化腺癌BGC-823細胞中低表達;以

7、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L4種不同濃度的白藜蘆醇作用于BGC-823細胞24h、48h、72h后PDCD5蛋白表達均較空白對照組有所升高;3個時間段內(nèi)隨著濃度增加,PDCD5蛋白表達增高,且呈濃度依賴性,50-200μmol/L白藜蘆醇組與空白對照組及溶劑對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),各實驗組之間兩兩相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);4個實驗組中隨著時間延長,PDCD

8、5蛋白表達升高,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);25μmol幾白藜蘆醇組、溶劑對照組與空白組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3個時間段內(nèi)實驗組及順鉑組與聯(lián)合組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),聯(lián)合組中PDCD5蛋白的表達隨著作用時間的延長而升高,以作用72h升高最顯著,三個時間段相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.原位雜交結(jié)果:PDCD5 mRNA在人胃低分化腺癌BGC-823細胞中低表達;以25μmol/L、50

9、μmol/L、100μmol/L、200μmol/L4種不同濃度的白藜蘆醇作用于BGC-823細胞24h、48h、72h后PDCD5 mRNA表達均較空白對照組有所升高;3個時間段內(nèi)隨著濃度增加,PDCD5 mRNA表達增高,白藜蘆醇濃度在50μmol/L以上實驗組與空白對照組及溶劑對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),各實驗組之間兩兩相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);4個實驗組中隨著時間延長,PDCD5mRNA表達升高,

10、差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);25μmol/L白藜蘆醇組、溶劑對照組與空白組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3個時間段內(nèi)實驗組及順鉑組與聯(lián)合組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),聯(lián)合組中PDCD5 mRNA的表達隨著作用時間的延長而升高,以作用72h升高最顯著,三個時間段相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3.流式細胞技術(shù)檢測細胞增殖分化結(jié)果:BGC-823細胞在經(jīng)25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L

11、、200μmol/L的白藜蘆醇處理24h、48h、72h后,G1期及G2期比例均較空白對照組有所下降,S期比例較空白對照組有所升高;3個時間段內(nèi)隨著濃度的升高,G1期、G2期比例逐漸下降,S期比例逐漸升高,50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L白藜蘆醇組與空白對照組及溶劑對照組相比,G1期、G2期比例的下降和S期比例的升高有統(tǒng)計學意義(P<0.05),各實驗組之間兩兩相比,S期比例的升高有統(tǒng)計學意義(P<0.05);同

12、一濃度的白藜蘆醇作用后隨著時間的延長G1期、G2期比例逐漸下降,S期比例逐漸升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05);25μmol/L白藜蘆醇組、溶劑對照組與空白組相比周期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3個時間段內(nèi)實驗組及順鉑組與聯(lián)合組相比,周期比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4.流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果:空白組BGC-823細胞流式細胞儀檢測是活細胞;在同一時間段的各個樣品中,隨著白藜蘆醇濃度的增加,細胞早期凋亡率和晚期凋亡

13、及壞死率逐漸升高,且早期凋亡率升高顯著,白藜蘆醇濃度在50μmol/L以上的實驗組與空白對照組及溶劑對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),各實驗組之間兩兩相比,細胞早期凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05):同一濃度的白藜蘆醇作用后隨著時間的延長細胞早期凋亡率和晚期凋亡及壞死率逐漸升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);25μmol/L白藜蘆醇組、溶劑對照組與空白組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3個時間段內(nèi)實驗組及順鉑組

14、與聯(lián)合組相比,細胞早期凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),晚期凋亡及壞死率差異不顯著(P>0.05)。5.TUNEL結(jié)果:用TUNEL方法檢測到的凋亡細胞的細胞核呈棕褐色,染色質(zhì)分布不均,染色深淺不一?？瞻讓φ战M中幾乎未見到凋亡細胞,而實驗組中的凋亡細胞數(shù)隨白藜蘆醇濃度的增加明顯增加,白藜蘆醇濃度50μmol/L以上實驗組,順鉑組及聯(lián)合用藥組與空白對照組及溶劑對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各實驗組之間兩兩相比,差異有

15、統(tǒng)計學意義(P<0.05);200μmol/L白藜蘆醇組與順鉑組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),其他白藜蘆醇組與順鉑組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);實驗組及順鉑組與聯(lián)合組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.白藜蘆醇能以劑量依賴的方式上調(diào)BGC-823細胞中PDCD5的蛋白及mRNA表達并使BGC-823細胞阻滯在S期、誘導細胞凋亡。2.白藜蘆醇誘導后BGC-823細胞出現(xiàn)細胞凋亡等一系列形態(tài)學