沉默LIMK1對(duì)DADS抑制人胃癌BGC823細(xì)胞增殖與遷移侵襲的影響.pdf

1、目的：在二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）通過(guò)LIMK1抑制人胃癌細(xì)胞增殖與遷移、侵襲的基礎(chǔ)研究上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)miRNA干擾人胃癌BGC823細(xì)胞，擬探討其LIMK1基因沉默后DADS抑制人胃癌BGC823細(xì)胞增殖與遷移、侵襲的變化及Rac1-Rock1/Pak1-Limk1-Cofilin1信號(hào)通路影響的機(jī)制。
　　方法：根據(jù)LIMK1基因序列設(shè)計(jì)：miRNA1、miRNA2、miRNA3、miR

2、NA4四個(gè)干擾序列，并設(shè)計(jì)1條非特異性序列作為陰性對(duì)照組。將含靶向 LIMK1的miRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌BGC823細(xì)胞，建立穩(wěn)定細(xì)胞系，通過(guò)Western blot、RT-PCR驗(yàn)證其對(duì) LIMK1表達(dá)的抑制作用；MTT實(shí)驗(yàn)用來(lái)觀察 DADS作用和BGC823細(xì)胞干擾LIMK1后對(duì)增殖的影響；Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別觀察DADS作用和干擾 LIMK1后 BGC823細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變；RT-PCR、Western

3、blot、免疫組化分別檢測(cè)DADS作用和干擾LIMK1后的BGC823細(xì)胞LIMK1的miRNA與蛋白表達(dá)。Western blot分別檢測(cè)Rac1、Rock1、Pak1、cofilin1的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建穩(wěn)定的pcDNA?6.2/Limk1-miRNA/BGC823重組細(xì)胞系
　　pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-Limk1-miRNA干擾質(zhì)粒提取后，將5組干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BGC823細(xì)

4、胞。經(jīng)殺稻瘟菌素篩選2w后，實(shí)驗(yàn)成功可見(jiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞漿內(nèi)發(fā)綠色熒光。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的LIMK1蛋白表達(dá)水平與陰性轉(zhuǎn)染組相比分別下降70.11％、15%、25.12%、72.32%，Limk1-miRNA4/BGC823對(duì)蛋白表達(dá)的抑制最明顯（P<0.05）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均用Limk1-miRNA4/BGC823細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　2.干擾Limk1后BGC823細(xì)胞增殖的影響。
　

5、　MTT結(jié)果顯示，干擾LIMK1表達(dá)可抑制BGC823細(xì)胞增殖。DADS處理后轉(zhuǎn)染細(xì)胞組24h后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖的抑制率明顯高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，繼續(xù)觀察48h、72h和96h后結(jié)果基本一致，提示干擾LIMK1表達(dá)增強(qiáng)了DADS的抑制細(xì)胞增殖作用。
　　3.干擾LIMK1對(duì)DADS抑制BGC823細(xì)胞遷移侵襲能力的影響
　　劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組及DADS處理轉(zhuǎn)染組的BGC823細(xì)胞作比較，取0h

6、、24h和48h三個(gè)不同時(shí)間段來(lái)觀察細(xì)胞劃痕愈合情況，未轉(zhuǎn)染組劃痕愈合顯著快于轉(zhuǎn)染組及DADS處理轉(zhuǎn)染組的BGC823細(xì)胞，證明轉(zhuǎn)染組及DADS處理后轉(zhuǎn)染組的BGC823細(xì)胞的遷移能力被抑制（P<0.05）。
　　Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在體外經(jīng)過(guò)DADS作用和將LIMK1基因沉默可降低人胃癌BGC823細(xì)胞的侵襲能力。
　　4.DADS處理及干擾LIMK1后BGC823細(xì)胞LIMK1表達(dá)的影響
　　RT-PC

7、R和Western blot和免疫組化結(jié)果均顯示，Limk1-miRNA4轉(zhuǎn)染組和經(jīng)DADS分別處理未轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組24 h后的LIMK1表達(dá)水平均明顯低于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組（P<0.05）。表明DADS和將LIMK1基因沉默可以抑制LIMK1的表達(dá)。
　　5.干擾LIMK1對(duì)BGC823細(xì)胞Rac1-Rock1/Pak1-Limk1-cofilin1信號(hào)通路的影響
　　Western blot結(jié)果均顯示：轉(zhuǎn)染

8、組Rac1、Rock1、Pak1、p-cofilin1的蛋白表達(dá)水平均下降，未轉(zhuǎn)染組及陰性轉(zhuǎn)染組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。cofilin1蛋白表達(dá)無(wú)差異。沉默LIMK1可抑制cofilin1的磷酸化水平和對(duì)Rac1-Rock1/Pak1通路具有抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.沉默LIMK1基因可抑制BGC823細(xì)胞增殖與遷移侵襲。
　　2.沉默LIMK1基因可增強(qiáng)DADS抑制BGC823細(xì)胞增殖與遷移侵襲。
　　3. DAD