鈣化血管平滑肌細胞中CaN對PKGI的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:血管鈣化是多種疾病的病理基礎(chǔ),與動脈粥樣硬化關(guān)系最為密切,它使動脈機械性質(zhì)發(fā)生了改變,可造成血栓的形成、粥樣斑塊的破裂、外周血管堵塞缺血、主動脈狹窄、心肌缺血和梗死等嚴重后果,增加了氣囊血管成形術(shù)中血管破裂和心血管生物修復(fù)術(shù)失敗的風險。導致心臟瓣膜鈣化的主要原因是機械損傷和炎癥,累及的主要部位在主動脈瓣和二尖瓣,鈣化的結(jié)果可致瓣膜狹窄和/或返流,是心臟瓣膜置換術(shù)的重要原因所在。以上所述的血管以及心臟瓣膜的鈣化是心血管發(fā)生鈣化的常見

2、部位。
　　 以往認為血管細胞鈣化是鈣鹽在細胞內(nèi)及細胞外基質(zhì)的被動沉積,是血管細胞老化的標志,然而新近的研究發(fā)現(xiàn)血管細胞鈣化是一個復(fù)雜的、主動的、可調(diào)控的生物學過程,是活躍的血管結(jié)構(gòu)的骨化,類似于骨和軟骨形成過程中的骨化。
　　 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CaN)是一種絲氨酸.蘇氨酸蛋白磷酸酶。CaN廣泛分布在多種組織細胞中,是一種多功能信號酶,主要通過使NFAT等底物的去磷酸化及核內(nèi)轉(zhuǎn)位,激活下游基因使其

3、轉(zhuǎn)錄,參與調(diào)節(jié)多種細胞的功能。最近研究證實,CaN信號通路參與了血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖和功能的維持。不同的刺激物(如PDGF2BB、凝血酶和AngⅡ等)可誘導NF-AT傳遞胞外信號,激活VSMC核內(nèi)相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄,最終刺激VSMC增殖,這一過程可被CaN特異性抑制劑CsA阻斷。
　　 環(huán)鳥苷酸依賴的蛋白激酶(cGMP-dependent protein kina

4、se,PKG)是廣泛的存在于真核細胞內(nèi)部的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。一氧化氮(nitric oxide,NO)能調(diào)節(jié)多種信號傳導通路,可促進細胞內(nèi)cGMP合成,然后由cGMP激活PKG進而調(diào)節(jié)局部和全身信號等。近年來研究CaN與血管鈣化中PKG關(guān)系的實驗有很多,而CaN在鈣化的VSMCs胞漿內(nèi)與PKG I的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未見有報道。
　　 本試驗采用磷酸二氫鈉建立大鼠主動脈VSMCs鈣化模型,測定細胞PKG I及CaN mR

5、NA、蛋白質(zhì)的表達及活性,并觀察CaN對PKGI表達的影響,初步探討CaN及PKG I對血管細胞鈣化的調(diào)節(jié)作用,為血管細胞鈣化的臨床防治提供新的思路。
　　 方法:大鼠胸大動脈VSMCs傳代完成后,將實驗細胞隨機分為3組。A組:對照組;B組:鈣化組;C組:干預(yù)組(簡稱CsA組)。A組給予正常對照的GMDM培養(yǎng)基3ml,B組給予磷酸二氫鈉配制濃度為2mmol/L的GMDM培養(yǎng)基3ml,C組給予磷酸二氫鈉配制濃度為2mmol/L的G

6、MDM培養(yǎng)基3ml同時加入濃度為5mg/L的環(huán)保霉素A(CsA)30ul,分別培養(yǎng)6天,每3天換液一次,于第6天收集細胞。茜素紅染色示鈣化組大鼠主動脈VSMCs呈梭形,排列紊亂,可見大量褐色鈣化點,提示細胞鈣化成功。取材后每組用Ellesa法測定大鼠主動脈VSMCs CaN、Ca2+活性,實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法測定CaNBmRNA和PKG I mRNA,Western blot測定CaNB及PKG I蛋白定量,采用比色法測定堿性磷酸

7、酶(ALP)活性;所有數(shù)據(jù)以均數(shù)4-標準差((x)±s)表示,運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,首先對計量資料進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗,組間資料比較應(yīng)用單因素方差分析,兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗,P＜0.05即有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:(1)茜素紅染色結(jié)果示對照組大鼠主動脈VSMCs呈梭形,排列整齊,未見鈣化點;鈣化組大鼠主動脈VSMCs呈梭形或多角形,排列紊亂,可見褐色鈣化點;CsA組大鼠主動脈VSMCs呈梭形或多角形,排列

8、紊亂,也可見大量褐色鈣化點。(2)實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法結(jié)果顯示:鈣化組與對照組對比:鈣化組CaNB mRNA(6.27±1.45)較對照組(1.10±0.28)表達顯著增加(P＜0.01);鈣化組PKG I mRNA表達(0.26±0.07)較對照組(0.89±0.17)表達顯著減少(P＜0.01);CsA組與對照組對比:CsA組CaNBmRNA(3.38±0.77)較對照組(1.10±0.28)表達顯著增加(P＜0.01);Cs

9、A組PKG I mRNA(0.60±0.12)較對照組(0.89±0.17)表達顯著減少(P＜0.01);鈣化組與CsA組對比:CsA組CaNB mRNA(3.38±0.77)較鈣化組(6.27±1.45)表達顯著減少(P＜0.01)。CsA組PKG I mRNA(0.60±0.12)較鈣化組(0.26±0.07)表達顯著增加(P＜0.01)。(3)Western blot法測定結(jié)果顯示:鈣化組與對照組對比:鈣化組CaNB蛋白(69.1

10、1±2.51)較對照組(29.9±1.39)表達顯著增加(P＜0.01),PKG I蛋白(0.32±0.01)較對照組(1.54±0.02)表達顯著減少(P＜0.01);CsA組與對照組對比:CsA組CaNB1蛋白(48.22±2.47)較對照組(29.9±1.39)表達顯著增加(P＜0.01),PKG I蛋白(0.77±0.03)較對照組(1.54±0.02)表達也顯著減少(P＜0.01);CsA組與鈣化組對比:CsA組CaNB蛋白(

11、48.22±2.47)較鈣化組(69.11±2.51)表達顯著減少(P＜0.01),PKG I蛋白(0.77±0.03)較鈣化組(0.32±0.01)表達顯著增加(P＜0.01)。(4)ELISA法測定大鼠主動脈VSMCs CaN活性:鈣化組(21.47±1.86 IU/L)較對照組(14.31±0.24 IU/L)表達顯著增加(P＜0.01),CsA組(15.34±0.14 IU/L)較對照組(14.31±0.24 IU/L)表達無顯

12、著變化(P＞0.05),CsA組(15.34±0.14 IU/L)較鈣化組(21.47±1.86IU/L)表達顯著減少(P＜0.01)。(5)EMSA法測定大鼠主動脈VSMCsCa2+含量:鈣化組(9.01±0.32 pg/ml)較對照組(6.03±0.33 pg/ml)Ca2+濃度顯著增加(P＜0.01),CsA組(10.39±0.70 pg/ml)較對照組(6.03±0.33pg/ml)Ca2+濃度顯著增加(P＜0.01),CsA組

13、(10.39±0.70 pg/ml)較鈣化組(9.01±0.32 pg/ml)Ca2+濃度顯著增加(P＜0.05)。(6)用比色法測定細胞內(nèi)ALP活性(U·g-1protein),相對于對照組(38.74±2.23),鈣化組的ALP活性(146.04±9.02)顯著增高(P＜0.01),但比CsA組(216.69±14.0)其ALP活性顯著降低(P＜0.01);CsA組(216.69±14.0)較對照組(38.74±2.23)顯著增高(