體外構(gòu)建生物角膜的實驗研究.pdf

1、角膜混濁發(fā)病率高、治療困難,是當(dāng)今世界致盲的主要原因之一.目前主要治療方法是板層或穿透性角膜移植,但受到了角膜供體來源缺乏、供體老齡化以及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等限制.利用新興的生物工程和組織工程技術(shù)在體外構(gòu)建出生物角膜以替代供體角膜移植,以及體外培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植以治療角膜內(nèi)皮失代償疾病,成為當(dāng)前研究的熱點和難點.本研究設(shè)計以脫細(xì)胞基質(zhì)為支架,在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)全層生物角膜;同時以羊膜基底膜為載體培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行移植. 目的：

2、 以異種角膜脫細(xì)胞基質(zhì)為載體支架,探索生物反應(yīng)器內(nèi)組織工程化角膜的體外構(gòu)建的技術(shù)和方法.以羊膜基底膜為載體培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞,體外構(gòu)建角膜內(nèi)皮層進(jìn)行兔角膜后板層內(nèi)皮移植實驗,為角膜內(nèi)皮層移植提供新的方法. 材料和方法: 1.機械分離兔角膜上皮層、基質(zhì)層和內(nèi)皮層,聯(lián)合應(yīng)用組織塊法和消化法獲得原代角膜細(xì)胞,細(xì)胞生長融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng),并對三種細(xì)胞分別進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測. 2.體外制備豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)和幾丁糖載

3、體,分別種植培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基質(zhì)層的構(gòu)建,同時將兩種載體材料移植到兔角膜基質(zhì)板層囊袋中觀察其生物相容性. 3.將綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的角膜基質(zhì)細(xì)胞種植于脫細(xì)胞基質(zhì)載體內(nèi)部,生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)獲得基質(zhì)層,內(nèi)外表面分別種植角膜內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞,繼續(xù)在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)全層角膜,對其結(jié)構(gòu)和特性進(jìn)行檢測. 4.以羊膜基底膜為載體培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞,對切除后板層的兔角膜進(jìn)行移植,以無培養(yǎng)細(xì)胞的羊膜移植和單純角膜后板層切除

4、為對照,術(shù)后觀察角膜透明度及厚度,并進(jìn)行組織學(xué)檢測. 結(jié)果： 1.體外培養(yǎng)的兔角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞生長良好,增殖旺盛,可連續(xù)傳代培養(yǎng)擴增;上皮細(xì)胞表達(dá)其特異性角膜白CK3、基質(zhì)細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽性、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)水通道蛋白AQP1. 2.角膜脫細(xì)胞基質(zhì)載體具膠原板層結(jié)構(gòu),體外構(gòu)建的基質(zhì)層與正常角膜相似,生物相容性良好;幾丁糖網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)疏散,移植后降解快,但產(chǎn)生明顯的炎癥和排斥反應(yīng). 3.GFP標(biāo)記的角

5、膜基質(zhì)細(xì)胞鑲嵌在載體支架內(nèi),形成三維結(jié)構(gòu)的基質(zhì)層;生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的角膜組織具復(fù)層上皮,板層基質(zhì)和單層內(nèi)皮層,與正常角膜結(jié)構(gòu)相似;各層細(xì)胞表達(dá)其細(xì)胞表面標(biāo)志. 4.角膜內(nèi)皮細(xì)胞在羊膜基底膜上融合成單層;培養(yǎng)內(nèi)皮層移植后角膜維持相對的透明及薄度,而兩對照組角膜嚴(yán)重水腫、混濁,厚度皆明顯高于實驗組角膜,三組比較有顯著性差異. 結(jié)論： 1.聯(lián)合應(yīng)用組織塊和酶消化法獲取純度高、活力好的原代細(xì)胞,體外培養(yǎng)可獲連續(xù)傳代擴增,

6、各細(xì)胞表達(dá)其細(xì)胞表面標(biāo)志. 2.異種角膜脫細(xì)胞基質(zhì)在形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及生物相容性上比幾丁糖網(wǎng)狀纖維更適于作為體外構(gòu)建生物角膜的載體支架,而幾丁糖材料則需要進(jìn)一步改進(jìn). 3.角膜脫細(xì)胞基質(zhì)是構(gòu)建生物角膜的良好載體,通過分別種植角膜基質(zhì)、內(nèi)皮和上皮細(xì)胞,在生物反應(yīng)器中動態(tài)培養(yǎng),可在體外構(gòu)建出近似正常組織結(jié)構(gòu)的全層生物角膜. 4.羊膜基底膜可促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長和增殖,體外重建角膜內(nèi)皮層進(jìn)行后板層移植,有望代替供體穿透性