多糖生物膜體外構(gòu)建兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞載體及移植的研究.pdf

1、目的：角膜的高度透明性和光學(xué)性是正常發(fā)揮生理功能的必要條件之一，而角膜內(nèi)皮細(xì)胞(corneal endothelial cell，CEC)在維持角膜的正常生理功能方面起重要作用。角膜內(nèi)皮細(xì)胞是角膜后層的單層細(xì)胞，構(gòu)成了后彈力層和房水之間的物理屏障，通過離子“泵”功能調(diào)節(jié)角膜中離子濃度和水分，維持角膜的半脫水狀態(tài)，保證角膜的正常厚度和透明度。一旦角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能出現(xiàn)紊亂，常導(dǎo)致角膜水腫而使角膜部分甚至完全失去透明性。穿透性角膜移植術(shù)是目前

2、取代病變或受損角膜，恢復(fù)角膜透明性的主要治療方法，但供體來源短缺、供體質(zhì)量的差異、部分排斥反應(yīng)以及術(shù)后并發(fā)癥等因素嚴(yán)重制約了角膜移植術(shù)的普及。研制人工角膜內(nèi)皮作為人體角膜的等效物是解決上述問題的最有效方法。隨著組織工程技術(shù)的興起和發(fā)展，組織工程角膜成為諸多學(xué)者關(guān)注的研究熱點。理想的人工角膜內(nèi)皮應(yīng)與受體組織有良好的生物相容性，故支架材料的選擇是重要的影響因素。殼聚糖是一種聚陽離子多糖，其特有的理化性質(zhì)已成為醫(yī)藥界及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。

3、研究證明，殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、降解可控性、抗眼組織纖維化以及抑菌性，在醫(yī)用材料領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。生物可降解物質(zhì)殼聚糖及其衍生物作為角膜細(xì)胞載體是一個新的研究方向。本研究旨在探討殼聚糖及其衍生物作為細(xì)胞活性載體進(jìn)行角膜內(nèi)皮損傷修復(fù)的應(yīng)用前景。 方法：試驗分三部分： 一、角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)：啟動兔、狗、貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)，摸索行之有效的角膜內(nèi)皮細(xì)胞傳代、保種方法，同時為得到足量種子細(xì)胞，

4、探討了海洋活性物質(zhì)對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖作用。 二、幾種殼聚糖共混膜片的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞相容性及其在兔前房組織相容性研究的比較：63101、63102、63103三種不同殼聚糖共混膜片作為載體，進(jìn)行體外角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，觀察細(xì)胞相容性、貼附牢固度及膜片強度的觀察；30只新西蘭白兔分為三組，分別于前房內(nèi)植入三種膜片，進(jìn)行裂隙燈、角膜厚度、角膜內(nèi)皮鏡和組織學(xué)檢查，比較三種共混膜片的前房相容性，另取3只新西蘭白兔僅作前房穿刺，作為對照

5、，以期篩選出適合角膜內(nèi)皮細(xì)胞貼附生長、有移植可行性、有良好前房相容性的載體支架。 三、兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性載片的培養(yǎng)及移植研究：選擇性能最佳的載體膜片作為載體支架，體外培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)適宜密度。 取15只新西蘭白兔制作兔眼角膜內(nèi)皮損傷模型，其中3只原位縫合作空白組，其余12只隨機分為2組，分別在角膜后彈力層面植入載有兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的殼聚糖共混膜片和不載細(xì)胞的殼聚糖共混膜片，作為對照組和試驗組，觀察兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性載片

6、對兔角膜內(nèi)皮損傷的修復(fù)能力。 結(jié)果： 一、成功啟動了兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)，且此培養(yǎng)方法對于幾乎無體內(nèi)增殖能力的狗、貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞同樣適用，說明其可能也適用于人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)；測定了兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的DOT，并通過對細(xì)胞貼壁率、伸展率的測定，篩選了行之有效的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞凍存方法；以EGF為對照，發(fā)現(xiàn)N-乙?；咸烟呛蜌す烟蔷哂写龠M(jìn)細(xì)胞生長和增殖的良好效果。 二、在三種殼聚糖膜片中，63103組膜片與角膜內(nèi)

7、皮細(xì)胞相容性好，細(xì)胞可在膜上形成良好單層并且貼附牢固，膜片在經(jīng)37℃孵育后仍保持良好的機械性能，有手術(shù)移植可行性；63103膜片與眼前房組織相容性良好，植入前房后炎癥反應(yīng)輕微。 三、掃描電鏡顯示及LDH釋放試驗結(jié)果表明，生長在63103膜片上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)良好，與生長在細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞相比，細(xì)胞膜穩(wěn)定性更佳。試驗結(jié)果顯示，該角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性載體膜片在兔眼眼內(nèi)移植早期，與對照組相比，實驗組移植區(qū)的透明率較高。 結(jié)