利用魚類膠原蛋白支架體外構(gòu)建組織工程全層人角膜的研究.pdf

1、目前，臨床上治療角膜病盲的唯一有效手段是角膜移植。但遺憾的是，由于捐獻(xiàn)角膜數(shù)量的嚴(yán)重不足及捐獻(xiàn)角膜老化，致使絕大數(shù)角膜病盲患者無法通過角膜移植重見光明。近年來角膜組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，使組織工程角膜的體外構(gòu)建成為可能，而組織工程角膜作為捐獻(xiàn)角膜的等效替代物，則是目前從根本上解決捐獻(xiàn)角膜高度匱乏問題、使眾多角膜病盲患者恢復(fù)視功能的唯一希望。如何獲得足量正常的種子細(xì)胞和生物相容性理想的載體支架一直是制約組織工程角膜規(guī)模化體外構(gòu)建的兩大因素

2、，已成為角膜組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在種子細(xì)胞方面，目前的研究主要集中在干細(xì)胞、轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞系和原代組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)上，但由于體外培養(yǎng)條件、倫理或潛在致瘤性等多種限制，目前仍無法滿足組織工程角膜規(guī)?；瘶?gòu)建對(duì)種子細(xì)胞的需求。近年來，本實(shí)驗(yàn)室成功建立了非轉(zhuǎn)染無致瘤性的HCE、HCS和HCEP的三種組織細(xì)胞系，并以其為種子細(xì)胞先后進(jìn)行了組織工程人角膜內(nèi)皮、基質(zhì)和上皮的體外構(gòu)建研究，達(dá)到了較為理想的動(dòng)物移植效果，使利用非轉(zhuǎn)染人角膜組織細(xì)

3、胞系規(guī)模化構(gòu)建組織工程角膜成為可能。在載體支架方面，目前的研究主要集中在天然生物材料、人工合成高分子材料和生物大分子復(fù)合材料方面。鑒于天然生物材料或多或少地受到其病原體攜帶風(fēng)險(xiǎn)和來源的限制、人工合成高分子材料還存在有生物相容性不理想等缺陷，學(xué)者們便逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到生物大分子復(fù)合材料的研發(fā)方面。在生物大分子復(fù)合材料的研究中，膠原蛋白由于具有來源廣泛、在進(jìn)化上高度保守、免疫原性低且生物相容性理想等諸多優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于各種載體支架材料的

4、制備研究，且利用人膠原蛋白復(fù)合支架成功構(gòu)建出了組織工程角膜，但遺憾的是，所制備出的膠原蛋白復(fù)合支架仍然存在有力學(xué)性能欠佳、體內(nèi)降解速度過快和制備成本較高等缺陷。近年來，高效無毒交聯(lián)劑及其交聯(lián)技術(shù)的快速發(fā)展以及非酶解/完整分子魚類膠原蛋白制備技術(shù)的建立，為利用魚類膠原蛋白制備組織工程角膜載體支架創(chuàng)造了條件。本文在前期研究工作的基礎(chǔ)上，首次利用本實(shí)驗(yàn)室自主分離純化的非酶解/完整分子魚類膠原蛋白啟動(dòng)了魚類膠原蛋白支架的制備研究，進(jìn)而以其為載體

5、支架、以非轉(zhuǎn)染無致瘤性的三種組織細(xì)胞系作為種子細(xì)胞進(jìn)行了組織工程全層人角膜(TE-flHC)的體外構(gòu)建研究，旨在建立魚類膠原蛋白支架的制備與TE-flHC體外構(gòu)建的技術(shù)工藝，獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)、屬性和功能蛋白表達(dá)正常的TE-flHC。
　　為了利用魚類膠原蛋白制備出生物相容性理想的載體支架，本文采用本實(shí)驗(yàn)室業(yè)已純化的孔鰩魚皮膠原蛋白，選用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS）交聯(lián)劑和自制模具

6、，進(jìn)行了魚類膠原蛋白支架的制備和鑒定。魚類膠原蛋白的鑒定結(jié)果顯示，所純化的孔鰩魚皮膠原蛋白純度高，在SDS-PAGE電泳中無雜帶，存在形式分別為單股α鏈、雙股α鏈和三股α鏈，單α鏈的分子量約為120 kDa，Gly含量約占總氨基酸含量的32.34％，符合膠原蛋白的分子量和氨基酸組成的基本特征，為未被降解的膠原蛋白完整分子，可用于魚類膠原蛋白復(fù)合支架的制備。在對(duì)所純化膠原蛋白進(jìn)行鑒定之后，本文以所得魚膠原蛋白為原料，采用自制裝置并通過ED

7、C/NHS交聯(lián)改性制備出了魚類膠原蛋白支架。含水量測(cè)定結(jié)果顯示，60 mg/mL、80 mg/mL和100 mg/mL膠原蛋白支架的含水量分別為90.53％±0.06％、89.88％±0.03％和86.34.％±0.11％l透明度與透光率結(jié)果顯示，上述三種膠原蛋白支架均具有良好的透明度，其透光率分別為91.15±2.36％、89.77±2.30％和86.09±2.31％;力學(xué)性能檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加膠原蛋白支架的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率隨膠原

8、蛋白的濃度升高而提高。冰凍切片HE染色和掃描電鏡結(jié)果表明，100 mg/mL膠原蛋白支架相對(duì)于60 mg/mL和80 mg/mL膠原蛋白支架，其組織結(jié)構(gòu)較為致密，膠原纖維連續(xù)，孔徑大小均勻，內(nèi)部結(jié)構(gòu)最佳。以上結(jié)果說明，所制備的魚類膠原蛋白支架具有良好的光學(xué)性能、力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu)，可望用作TE-flHC體外構(gòu)建的載體支架。
　　為了獲得足量的人角膜種子細(xì)胞，本文首先對(duì)業(yè)已建立的三種非轉(zhuǎn)染人角膜組織細(xì)胞系進(jìn)行了擴(kuò)增培養(yǎng)和鑒定。形態(tài)觀

9、察和生長(zhǎng)曲線的鑒定結(jié)果顯示，HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞仍分別保持有上皮樣、成纖維樣和多角形內(nèi)皮樣的形態(tài)特征，其群體倍增時(shí)間分別為38.5h、37.6 h和36.2 h;染色體鑒定結(jié)果顯示，這三種細(xì)胞的特征染色體數(shù)目均為2n=46條l免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCEP細(xì)胞仍保持有其標(biāo)志蛋白——角蛋白3/12以及功能蛋白——緊密連接蛋白(ZO-1)，整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白-43、鈉鉀泵和乙醛脫氫酶的陽性表達(dá);HCS細(xì)胞仍保持有

10、其標(biāo)志蛋白——波形蛋白以及功能蛋白——整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白-43、鈉鉀泵和乙醛脫氫酶(ALDH)的陽性表達(dá)lHCS細(xì)胞仍保持有標(biāo)志蛋白——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體蛋白(FLK-1)以及功能蛋白——整聯(lián)蛋白β5，緊密連接蛋白（ZO-1），間隙連接蛋白-43和鈉鉀泵的陽性表達(dá)。這些結(jié)果表明，體外擴(kuò)增培養(yǎng)的三種人角膜組織細(xì)胞在形態(tài)、增殖能力、染色體特征以及功能蛋白表達(dá)方面仍然具有典型的原有屬性和發(fā)揮形成細(xì)胞連接和穿膜運(yùn)輸?shù)臐撃?，可作為種子細(xì)

11、胞用于TE-flHC的體外構(gòu)建。
　　為了驗(yàn)證所制備的魚類膠原蛋白支架的生物相容性，本文在獲得足量的人角膜種子細(xì)胞后，利用MTT法、RT-PCR和免疫組織化學(xué)等方法檢測(cè)了支架對(duì)三種人角膜組織細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖調(diào)控基因表達(dá)以及功能蛋白表達(dá)的影響作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚類膠原蛋白支架浸提液對(duì)體外培養(yǎng)的HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞的細(xì)胞活力沒有顯著影響(P＞0.05)。RT-PCR結(jié)果表明，支架對(duì)三種種子細(xì)胞生

12、長(zhǎng)和增殖基因的表達(dá)水平也沒有顯著影響(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，HCEP細(xì)胞在接種于支架表面后仍能保持其標(biāo)志蛋白——角蛋白3/12、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白β1、ZO-1和間隙連接蛋白-43以及功能蛋白——鈉鉀泵和ALDH的陽性表達(dá)lHCS細(xì)胞在接種子支架表面后仍能保持其標(biāo)志蛋白——波形蛋白、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白β1和間隙連接蛋白-43、以及功能蛋白——鈉鉀泵和ALDH的陽性表達(dá);HCE細(xì)胞在接種于支架表面后

13、仍能保持其標(biāo)志蛋白——FLK-1、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白β5、ZO-1和間隙連接蛋白-43、以及功能蛋白——鈉鉀泵的陽性表達(dá)。這些結(jié)果表明，所制備的魚類膠原蛋白支架對(duì)三種人角膜組織細(xì)胞不僅沒有毒性，而且對(duì)其生長(zhǎng)增殖調(diào)控基因、標(biāo)志蛋白及功能蛋白的表達(dá)沒有任何影響作用，與三種人角膜組織細(xì)胞具有理想的生物相容性，可以作為載體支架用于TE-flHC的體外構(gòu)建。
　　在獲得足量正常的三種人角膜組織細(xì)胞和生物相容性理想的魚類膠原蛋白支架

14、后，本文以三種人角膜組織細(xì)胞為種子細(xì)胞、以魚類膠原蛋白支架為載體支架，進(jìn)行了TE-flHC的體外構(gòu)建和鑒定研究。我們?cè)趦?yōu)化種子細(xì)胞的接種天數(shù)后，分別將HCS細(xì)胞、HCE細(xì)胞和HCEP細(xì)胞接種于魚類膠原蛋白支架，通過浸沒培養(yǎng)或液氣-液界面培養(yǎng)數(shù)天后成功構(gòu)建TE-flHC，并通過外觀觀察、透明度檢測(cè)、冰凍切片HE染色、熒光標(biāo)記物檢測(cè)、茜素紅染色、透射電鏡、掃描電鏡和免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)其透光性能、組織結(jié)構(gòu)及種子細(xì)胞的蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行鑒定。透

15、光性能檢測(cè)結(jié)果表明，構(gòu)建的TE-flHC具有良好的透光率與透明度，具有類似正常角膜的高透光性能。熒光標(biāo)記物檢測(cè)與HE染色結(jié)果表明，三種人角膜細(xì)胞分界明顯，HCEP細(xì)胞在支架表面形成5至8層復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)lHCS細(xì)胞均勻分布于支架內(nèi)部;HCE細(xì)胞形成完整的細(xì)胞單層結(jié)構(gòu)。茜素紅染色結(jié)果表明，細(xì)胞密度為2750±260個(gè)/mm2，相當(dāng)于30歲成年人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，HCEP細(xì)胞具有豐富的微絨毛結(jié)構(gòu)，角膜上皮細(xì)胞與魚類膠原蛋

16、白支架的連接處存在致密的基底膜，并且細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-支架之間結(jié)合緊密lHCS細(xì)胞呈纖維樣，形態(tài)伸展，與魚類膠原蛋白支架連接緊密;HCE細(xì)胞平整連續(xù)，形成了由完整的單層結(jié)構(gòu)，與正常角膜內(nèi)皮層相似。以上結(jié)果說明構(gòu)建的TE-flHC具有類似于正常角膜的解剖結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，三種人角膜組織細(xì)胞均能維持其原有屬性，并且形成了緊密連接、錨定連接和通訊連接，具有正常角膜相似的進(jìn)行膜泡運(yùn)輸和抗UV氧化損傷的功能。
　　綜上所述，本

17、文利用孔鰩皮膠原蛋白制備出了光學(xué)性能、力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu)良好且與HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞具有理想生物相容性的魚類膠原蛋白支架，進(jìn)而以膠原蛋白支架為載體支架，以屬性正常、增殖能力旺盛及功能蛋白表達(dá)正常的非轉(zhuǎn)染HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞為種子細(xì)胞，成功體外構(gòu)建出了與正常角膜結(jié)構(gòu)、屬性與功能相似的組織工程全層角膜。本文研究結(jié)果，對(duì)于魚類膠原蛋白在組織工程領(lǐng)域的高質(zhì)化應(yīng)用具有重要意義，為我國(guó)數(shù)百萬、全世界有數(shù)千萬角膜病盲患