NLRX1抑制LUBAC介導的NF-κB激活的機制研究.pdf

1、蛋白翻譯后的泛素化修飾在調節(jié)各種細胞生物功能的過程中發(fā)揮著關鍵的作用。近幾年新發(fā)現(xiàn)的線性泛素鏈組裝復合體(linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)由HOIP、HOIL-1L和SHARPIN組成，能夠產生一種新型的Met1連接的線性多聚泛素鏈，可以特異性調控經(jīng)典的NF-κB信號通路，是天然免疫反應的重要組成部分。
　　NLRs是一類重要的胞漿型模式識別受體(PRR)，負責識別細胞內

2、信號，是固有免疫針對病原微生物的一類重要感受器。NLRX1是NLRs家族中唯一定位于線粒體的成員，結構較為保守，能夠通過多種途徑參與NF-κB信號通路的調控，而NLRX1對LUBAC介導的NF-κB信號通路的調控作用尚未有人報道。因此，本論文以NLRX1為研究對象，初步探討了其對LUBAC介導的NF-κB信號通路的影響，并進一步解釋其作用機制。主要研究內容如下:
　　1.NLRX1抑制LUBAC誘導的NF-κB啟動子活化
　

3、　在HEK-293T細胞中，分別轉染LUBAC、NF-κB-Luc、pRL-TK和不同劑量的NLRX1真核表達質粒，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠顯著抑制LUBAC激活的NF-κB啟動子活性，并且呈劑量依賴性。說明NLRX1能夠負調控LUBAC介導的NF-κB信號通路。
　　2.從互作角度探究NLRX1和LUBAC的關系
　　LUBAC由HOIL-1L、HOIP和SHARPIN組成，為了探究NLRX1負調控LUBA

4、C介導的NF-κB信號通路的作用機制，我們首先從互作角度探究NLRX1和LUBAC的關系。通過免疫共沉淀實驗(CO-IP)發(fā)現(xiàn)，超表達條件下NLRX1與HOIL-1L、HOIP和SHARPIN均存在相互作用，但生理條件下，NLRX1只與HOIP存在互作，且NLRX1是通過其NOD結構域與HOIP的UBA結構域互作;同時還發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠抑制LUBAC復合物的形成，減少LUBAC對NEMO的招募。
　　3.NLRX1發(fā)揮負調控作用

5、的關鍵結構域為LRR結構域
　　為了探究NLRX1發(fā)揮負調控作用的關鍵結構域，構建了NLRX1的4個截短突變體，NLRX1-N-ter(1-468bp)、NLRX1-ΔN-ter(469-2928bp)、NLRX1-LRR(976-2928bp)和NLRX1-ΔLRR(1-975bp)。用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析，結果發(fā)現(xiàn)NLRX1的LRR結構域在負調控LUBAC依賴的NF-κB通路中發(fā)揮著重要作用。
　　4.NLRX1對LU

6、BAC定位及表達的影響
　　利用間接免疫熒光實驗(IFA)檢測NLRX1對LUBAC定位的影響，發(fā)現(xiàn)NLRX1和LUBAC存在共定位且定位于胞漿，NLRX1對LUBAC的定位幾乎沒有影響。熒光定量PCR實驗表明NLRX1也不影響LUBAC的mRNA水平;Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)NLRX1特異性抑制HOIP的表達，且呈劑量依賴性，但用MG132處理后，與對照組相比，HOIP的表達得到恢復，表明NLRX1介導的HOIP的降解是

7、通過蛋白酶體途徑實現(xiàn)的。
　　5.NLRX1抑制NEMO的線性泛素化修飾
　　在LUBAC介導的NF-κB信號通路中，LUBAC能夠招募NEMO并對其進行線性泛素化修飾，引起IKK復合物的活化及IκBα的降解，促使NF-κB的釋放和入核。為了驗證NLRX1降解HOIP的生物學意義，通過免疫共沉淀實驗檢測NLRX1對內源性NEMO的線性泛素化的影響，結果發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠抑制內源性NEMO的線性泛素化修飾，進而負調控LUBAC