載體介導siRNA抑制人RA滑膜細胞NF-κB基因表達的研究.pdf

1、目的：設(shè)計、合成核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(Nuclear transcription factor-kappaB，NF-kB)小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)表達載體，轉(zhuǎn)染人類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)滑膜細胞，篩選出特異性干擾人RA滑膜細胞NF-kB生成的siRNA表達載體，以探索抑制RA炎癥進展和關(guān)節(jié)破壞的新途徑。 方法: RA滑膜細胞源自RA滑膜切

2、除組織，經(jīng)分離、消化、培養(yǎng)和傳代后備用。根據(jù)GeneBank中人NF-kB mRNA全長開放讀框序列(L19067)，設(shè)計合成四條NF-kB的干擾序列(1?！?＃)及對照序列，構(gòu)建siRNA pGenesil-1/NF-kB表達載體，以復(fù)合陽離子脂質(zhì)體Effectene Transfection Reagent為介導，轉(zhuǎn)染重組真核表達載體NF-kB siRNA入滑膜細胞，轉(zhuǎn)染12h、24h、48h、72h、5d和第7d后分別收集細胞，提

3、取上述時間段細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(引物、探針均根據(jù)GeneBank中NF-kB mRNA全長開放讀框序列設(shè)計合成擴增)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time fluorescent quantitive polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)檢測滑膜細胞中NF-kBmRNA相對表達水平，分析重組真核載體的干擾效果。 結(jié)果: NF-kB真核表達載體pGenesil-1/NF-kB siRN

4、A轉(zhuǎn)染人滑膜細胞12h、48h、72h、5d和7d后，觀察到陽離子脂質(zhì)體Effectene Transfection Reagent對細胞毒性小，轉(zhuǎn)染后細胞在形態(tài)學上沒有差別，對細胞生長沒有明顯影響。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測定各時間段各組人滑膜細胞NF-kB mRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后12小時內(nèi)即可檢測到干擾效應(yīng)，48～72小時干擾效應(yīng)最強，此后活性逐漸降低，持續(xù)時間達7天，并且3＃Genesil-1/NF-kBsiRNA組與其它si