兩種抗生素合成基因在變鉛青鏈霉菌TK24中的異源表達.pdf

1、必特螺旋霉素是由生物工程菌Streptomyces spiramyceticus WSJ-1產(chǎn)生的一組4"異戊?；穆菪顾?。它是由4"異戊?；D(zhuǎn)移酶(ist)催化螺旋霉素4"羥基，使之異戊?；梢?"異戊酰基螺旋霉素為主組分的新抗生素。目前，必特螺旋霉素臨床試驗Ⅲ期已完成，且顯示出優(yōu)于陽性對照藥物阿齊霉素的療效。
　　 必特螺旋霉素工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物是一個多組分的混合物，除了主組分異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，還包括次組分和一

2、些小組分等。由于必特螺旋霉素因工程菌WSJ-1發(fā)酵液中主組分(異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分之和)的含量或比例不高，給發(fā)酵生產(chǎn)過程中的提取、純化和質(zhì)量控制等帶來較大的難題，因此有必要提高必特螺旋霉素主組分的產(chǎn)量。
　　 必特螺旋霉素基因工程菌WSJ-1發(fā)酵液中產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，在相當(dāng)水平的螺旋霉素沒有被4"-異戊酰化的情況下，增加4"-異戊?；D(zhuǎn)移酶活性和改善異戊酰基前體供應(yīng)，對于提高4"-異戊酰螺旋霉素的生物合成水平具有促

3、進作用。提高4"-異戊?；D(zhuǎn)移酶的表達水平來增加異戊酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而提高螺旋霉素的異戊酰化水平，對于簡化必特螺旋霉素的生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本，具有重要的實際意義。
　　 為了提高螺旋霉素生物轉(zhuǎn)化為4"-異戊酰螺旋霉素的水平，我們構(gòu)建了兩組重組質(zhì)粒，一組是pKC-e-ist-ist和pKC-ist-ist，它們分別含有5'-上游插入紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的4"-異戊?；D(zhuǎn)移酶基因串連雙拷貝，以及僅含有4"-異戊酰

4、基轉(zhuǎn)移酶基因串連雙拷貝；將它們分別導(dǎo)入到變鉛青鏈霉菌TK24中，比較它們對螺旋霉素的4"-異戊?；芰?。HPLC結(jié)果顯示，插入強啟動子PermE*的S.lividansTK24[pKC-e-ist-ist]比沒有插入強啟動子的S.lividans TK24[pKC-ist-ist]對螺旋霉素的4"-異戊酰化水平提高近4倍。另一組是pSET-e-ist-ist和pSET-e-ist,它們分別是含有5'-上游插入紅霉素抗性基因強啟動子Per

5、mE*的4"-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因串連雙拷貝，以及僅含有5'-上游插入紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的4"-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因單拷貝；同樣將它們轉(zhuǎn)化到變鉛青鏈霉菌TK24中進行生物轉(zhuǎn)化螺旋霉素，HPLC結(jié)果顯示含雙拷貝ist基因的S.lividans TK24[pSET-e-ist-ist]比單拷貝的S.lividans TK24[pSET-e-ist]對螺旋霉素的4"-異戊?；教岣呓黮倍。
　　 因此，在變鉛青鏈霉菌TK

6、24中，加入強啟動子PermE*和增加ist基因拷貝數(shù)都可以增強4"-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因表達，明顯提高對螺旋霉素的4"-異戊?；?。本研究結(jié)果將為未來提高必特螺旋霉素產(chǎn)生菌中異戊酰螺旋霉素主組分的生物合成水平提供重要的參考數(shù)據(jù)。
　　 格爾德霉素(geldanamycin，GDM)是一種苯醌型安莎類抗生素。GDM生物合成基因簇已被克隆和測序，對GDM生物合成已經(jīng)有了一個大體上的了解，但對參與GDM生物合成PKS后修飾步驟的酶蛋

7、白還有待深入研究。
　　 已知gdmN基因編碼參與格爾德霉素生物合成PKS后修飾的氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶。我們將紅霉素抗性基因強啟動子PermE*置于gdmN基因5'端上游，在S.lividansTK24中進行異源表達和微生物轉(zhuǎn)化CT-1-7(4，5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基格爾德霉素)，產(chǎn)生預(yù)計的化合物4，5-雙氫格爾德霉素，從而直接證實了gdmN基因的氨甲酰轉(zhuǎn)移酶功能。同時，該異源表達和生物轉(zhuǎn)化體系還可方便地用于CT-1-7類