鏈霉菌BM10菌株產(chǎn)抗植物疫霉菌抗生素的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、鏈霉菌(Streptomyces)BM10菌株是由本實(shí)驗(yàn)室于2005年從海南霸王嶺原始森林土壤中分離篩選得到的一株生防菌，前期研究結(jié)果表明，BM10菌株發(fā)酵液無(wú)菌濾液對(duì)香蕉枯萎病菌1、4號(hào)小種(F.oxysporumLsp.cubenseracel、race4)、黃瓜枯萎病菌(F。oxysporumf.spcucumerinum)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracap

2、sici)、香蕉炭疽病菌[Colletotrichummusae(Berk.etCurt.)Arx]等多種重要植物病原真菌具有強(qiáng)烈抑制作用，BM10菌株發(fā)酵液在自然光照8h、紫外線輻射2h、100℃加熱1h、pH2至pH12處理24h和貯存6個(gè)月等條件下抑菌活性保持穩(wěn)定，具有開(kāi)發(fā)成農(nóng)用抗生素的前景。本研究對(duì)鏈霉菌BM10菌株進(jìn)行了形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和生理生化性狀的鑒定，對(duì)其產(chǎn)生的抗生素進(jìn)行了分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定和對(duì)辣椒疫病防治效果進(jìn)行了

3、田間小區(qū)試驗(yàn)，其主要研究結(jié)果如下： 1.根據(jù)菌絲形態(tài)、孢子形狀、在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征及明膠液化、淀粉水解、纖維素上生長(zhǎng)情況、H2S的產(chǎn)生、碳源利用一系列生理生化特征，按照《放線菌的分離和鑒定》(閻遜初，1992)，結(jié)合BM10菌株16SrDNA序列分析結(jié)果，將鏈霉菌BM10菌株初步鑒定為鏈霉菌燼灰類(lèi)群白淺灰鏈霉菌的一個(gè)新菌株。 2。建立了從BM10菌株發(fā)酵液中分離純化抗生素的技術(shù)方法。將預(yù)處理后的發(fā)酵液，于45℃進(jìn)行

4、濃縮，經(jīng)乙酸乙酯萃取三次，合并濃縮獲得鏈霉菌BM10菌株活性物質(zhì)的粗提。以辣椒疫霉為活性追蹤測(cè)試菌，通過(guò)減壓柱層析、氯仿-甲醇梯度洗脫、硅膠柱層析、結(jié)晶和重結(jié)晶，獲得了單組份活性化合物SR-1。其技術(shù)流程為：活性粗提物質(zhì)(17.3g)-甲醇溶解，(60～80目)硅膠拌樣-減壓柱層析，以氯仿-甲醇梯度洗脫(比例為1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，V/V)-活性部分-硅膠柱層析-結(jié)晶，重結(jié)晶-單一活性化合

5、物SR-1，TLC展開(kāi)系統(tǒng)為氯仿：甲醇：水(8:2:0.2，V/V)，高錳酸鉀顯色為淡黃色，Rf值為0.425，HPLC檢測(cè)純度達(dá)97％。 3。通過(guò)理化性質(zhì)和UV、1H-NMR、13C-NMR等色譜分析，明確了SR-1是一個(gè)核苷類(lèi)化合物，分子量：291，分子式：C12H13N5O4，與已知化合物豐加霉素(Toyocamycin)結(jié)構(gòu)一致。 4.根據(jù)SR-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，經(jīng)文獻(xiàn)查詢(xún)和多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，建立了鏈霉菌BM10發(fā)酵液中

6、代謝產(chǎn)物SR-1含量檢測(cè)方法，流動(dòng)相：甲醇/水(V/V，1:4)，流量：0.6mL/min;柱溫：室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm，277nm；進(jìn)樣體積：10μL;tR=13.48min。求得回歸方程：Y=706.33X+0.0323，變異系數(shù)r=0.9999，線性范圍為：1.56μ/mL～12.5μg/mL，平均回收率為99.34％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.71％，不同容積的搖瓶中(1L、2L、5L)鏈霉菌BM10發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物SR-1的