VEGF誘導成神經分化的間充質干細胞定向遷移研究.pdf

1、中樞神經系統(central nervous system，CNS)損傷后的功能恢復非常困難，主要原因是腦內神經元的再生能力差。骨髓間充質干細胞(bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，BM-MSCs/MSCs)可在自體獲得且能在體外穩(wěn)定擴增，并可誘導分化成神經細胞，有望用于神經系統疾病的治療，故骨髓間充質干細胞向神經細胞分化相關的基礎研究是十分重要的。移植MSCs治療CNS損傷包括兩個重要的

2、因素：MSCs定向遷移至損傷部位；MSCs的成神經分化。
　　 體外實驗發(fā)現，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以誘導MSCs的遷移；在病理狀態(tài)下，損傷區(qū)域會釋放大量VEGF，誘導MSCs向損傷區(qū)域的遷移。VEGF和細胞膜上的血管內皮生長因子受體(vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR)結合，激活細胞外信號

3、調節(jié)激酶(extracelluar signal regulated kinases-1/2，ERK1/2)、應激活化蛋白激酶/c-jun氨基末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase，SAPK/JNK)、p38MAPK和磷脂酰肌醇3激酶/Akt(phosphatidylinositol3-kinase/Akt，PI3K/Akt)信號通路，進而介導細胞的增

4、殖、分化和遷移。
　　 本實驗室的的前期研究結果顯示，不同分化狀態(tài)的MSCs向C6膠質瘤條件培養(yǎng)基和SDF-1alpha遷移的細胞數不同，因此我們猜測MSCs的分化狀態(tài)影響它們的趨化性遷移，為了進一步驗證MSCs的成神經分化狀態(tài)和其遷移行為之間的關系，我們利用Dunn chamber和Boyden chamber檢測了成神經分化不同階段的MSCs向VEGF的定向遷移行為，同時Western blot檢測了和MSCs遷移密切相關的

5、PI3K/Akt和MAPKs通路對VEGF的應答。
　　 我們采用Percoll分離法在體外培養(yǎng)并擴增大鼠骨髓來源MSCs，應用抗氧化劑誘導方案誘導MSCs向神經樣細胞分化，運用Dunn chamber從個體水平研究分化細胞在VEGF濃度梯度下的遷移速率、遷移效率和遷移軌跡。接著，我們運用Boyden chamber從群體水平研究MSCs在成神經分化過程中的趨化性遷移(Chemotaxis)和隨機運動(Chemokinesis)

6、。Boyden chamber結果顯示，下室加入不同濃度VEGF后，不同狀態(tài)細胞向同一濃度VEGF遷移的數量不同，不同濃度VEGF誘導同一狀態(tài)細胞的遷移數量也不同，同時，利用活細胞工作站結合Dunnchamber對細胞進行微速攝影視頻分析(time-lapse video analysis)顯示在某一分化階段(預誘導24小時)的MSCs具有更高的遷移效率。接著，我們通過Western blot檢測了在。VEGF刺激下這些通路關鍵分子的磷

7、酸化水平的改變，結果顯示各條通路達到磷酸化最大值的時間不同，同一時間各條通路磷酸化的程度不同，而且這些現象隨著細胞狀態(tài)的改變而改變。最后，采用PI3K/Akt和MAPKs抑制劑阻斷信號通路后，利用Dunn chamber和Boyden chamber觀察抑制劑對細胞定向遷移的影響，結果顯示抑制劑對遷移的影響和分化的狀態(tài)密切相關，推測這些通路在成神經分化的MSCs定向遷移中是選擇性起作用的。
　　 以上結果證明，MSCs的分化影響

8、了其向VEGF的定向遷移，也就是說，不同分化狀態(tài)的MSCs顯示出不同的遷移行為。MSCs分化狀態(tài)影響其對誘導因子的趨化性遷移是一個普遍的現象，實驗室關于干細胞生長生長因子(hepatocyte growthfactor，HGF)，干細胞因子(stem cell factor，SCF)，血小板衍生因子(platelet derivedgrowth factor，PDGF)的研究同樣證明了這種現象的存在，雖然進一步的分子機制仍待于探索，但是