小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與成肌誘導(dǎo)分化研究.pdf

1、本研究運(yùn)用Ⅰ型膠原酶消化法分離4周齡雌性ICR小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCs)，進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，隨后觀察傳代生長(zhǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化，繪制生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行染色體分析，和細(xì)胞周期的測(cè)定。隨后用RT-PCR法對(duì)ADSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29，CD31，CD44，CD45。結(jié)果顯示小鼠ADSCs體外培養(yǎng)時(shí)呈成纖維細(xì)胞樣，增殖速度快，各代次細(xì)胞經(jīng)歷生長(zhǎng)潛伏期、指數(shù)

2、生長(zhǎng)期和平臺(tái)期，生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)異常，細(xì)胞表面標(biāo)志CD29陽(yáng)性率為95.51％，CD44為31.63％，CD31為20.22％，CD45表達(dá)量極少。RT-PCR檢測(cè)ADSCs的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果表明，小鼠ADSCs少量表達(dá)Oct-4和C-kit，大量表達(dá)Sca-1?？山?jīng)成脂誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞，經(jīng)過(guò)蘇丹黑染色顯藍(lán)色，并表達(dá)PPARγ2這一脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子。可經(jīng)成骨誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞，經(jīng)過(guò)茜素紅染色呈紅色，并表達(dá)鈣骨素基因。

3、
　　用膠原酶和胰酶聯(lián)合消化法消化分離小鼠原代肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，該方法比組織塊等方法得到衛(wèi)星細(xì)胞所用時(shí)間短。免疫熒光顯示其表達(dá)FITC標(biāo)記的Myod抗體和Cy3標(biāo)記的Desmin抗體。RT-PCR結(jié)果顯示，小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)MyoD，Myogenin和Myf5等生肌決定因子，其中MyoD的表達(dá)量最高。不同代次之間不同生肌決定因子的表達(dá)量不同，新分離的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和第二代細(xì)胞之間MyoD的表達(dá)量差異并不顯著，而MyoG的表達(dá)量差異

4、顯著，而Myf5的表達(dá)量差異極其顯著，說(shuō)明骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在傳代生長(zhǎng)過(guò)程中，迅速地發(fā)生分化，逐漸變?yōu)樯L(zhǎng)成熟的成肌細(xì)胞，失去分化增殖能力。
　　用不同濃度去甲基化試劑5-氮雜胞苷（5-Aza）處理間充質(zhì)干細(xì)胞尋找最佳培養(yǎng)條件后進(jìn)行成肌檢測(cè)。免疫熒光結(jié)果表明其定向分化為肌肉細(xì)胞的能力強(qiáng)，添加10μmol·L-15-Aza與10％的馬血清（HorseSerum，HS）的條件培養(yǎng)基可使誘導(dǎo)效果更好。誘導(dǎo)后部分相鄰細(xì)胞開(kāi)始融合，形成類(lèi)似肌管

5、樣的細(xì)胞，成肌特異性抗體anti-MyoD和anti-Desmin陽(yáng)性表達(dá)。5-Aza單獨(dú)誘導(dǎo)組、5-Aza與馬血清(HS)協(xié)同誘導(dǎo)組與陰性對(duì)照脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）組和陽(yáng)性對(duì)照第一代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)組，RT-PCR結(jié)果表明各組之間生肌決定因子MyoD，Myogenin和Myf5的表達(dá)量有差異，說(shuō)明其成肌分化的程度不同，并有改善空間。
　　因此，本研究分離培養(yǎng)得到小鼠ADSCs，該細(xì)胞取材容易，帶入雜質(zhì)細(xì)胞很少，分