定點(diǎn)整合hFⅧ的人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)成間充質(zhì)干細(xì)胞的研究.pdf

1、血友病A(hemophilia A，HA)是X染色體連鎖的單基因隱性遺傳病，其致病機(jī)理是患者有編碼人凝血Ⅷ因子(factorⅧ，F(xiàn)Ⅷ)基因的功能缺陷，目前該病是基因治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本研究組前期已經(jīng)成功利用人核糖體基因區(qū)打靶載體(pHmeo)將人凝血因子Ⅷ(hFⅧ)靶入到人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）rDNA區(qū)，統(tǒng)一命名為ET5，再擬將ET5分化為適宜血友病A移植的特異組織細(xì)胞，以

2、進(jìn)行血友病A的基因治療研究。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在自體、同種異體甚至異種異體體內(nèi)，能有效修復(fù)甚至完全重建功能嚴(yán)重受損的組織器官而不被排斥，不易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，已經(jīng)成為基因治療及組織修復(fù)等領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。已有人量研究表明MSCs可成為血友病A的理想靶細(xì)胞。但是成體MSCs取材較困難，而且難以體外長期擴(kuò)增培養(yǎng)，從而一定程度上限制了MSCs在作為基因治療靶細(xì)

3、胞中的應(yīng)用。因此本研究擬建立hESCs定向誘導(dǎo)成MSCs的平臺，為獲取數(shù)量足夠的MSCs提供新的途徑;本研究將以ET5為對象，定向誘導(dǎo)成MSCs，并檢測分化后細(xì)胞中hFⅧ的表達(dá)情況，為后續(xù)血友病A基因治療的臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的:初步建立hESCs定向誘導(dǎo)成MSCs的技術(shù)平臺，并研究由hESCs定向誘導(dǎo)的MSCs是否與骨髓來源MSCs的特性一致，以及外源基因在ET5誘導(dǎo)的MSCs中的表達(dá)情況。
　　 方法:

4、
　　 1.對ET5進(jìn)行堿性磷酸酶染色檢測后，聯(lián)合bFGF，PDGF-BB等細(xì)胞因子誘導(dǎo)ET5向MSCs分化，并進(jìn)行核型檢測;
　　 2.鑒定ET5誘導(dǎo)的MSCs在體外向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化的能力;
　　 3.流式分析ET5、ET5誘導(dǎo)的MSCs以及骨髓來源MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)情況;
　　 4.RT-PCR檢測ET5誘導(dǎo)成MSCs后Oct4、Sox2和Nanog基因的表達(dá)變化;
　　

5、 5.RT-PCR檢測由ET5誘導(dǎo)的MSCs中hFⅧ在RNA水平的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.ET5堿性磷酸酶染色陽性，表明ET5具備多潛能性，將ET5誘導(dǎo)成MSCs后，具有與骨髓來源的MSCs一致的細(xì)胞形態(tài)，在體外長期培養(yǎng)傳代后仍保持核型正常;
　　 2.ET5誘導(dǎo)成的MSCs，在體外仍具備多向分化潛能，可分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞;
　　 3.流式分析ET5誘導(dǎo)的MSCs和骨髓來源的