成神經(jīng)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向干細(xì)胞因子的趨化性遷移研究.pdf

1、目的：惡性膠質(zhì)瘤等原發(fā)腦瘤對人類危害極大,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能夠向膠質(zhì)瘤發(fā)生趨化性遷移,并且具有易于獲得、多向分化等優(yōu)點(diǎn),因而成為治療膠質(zhì)瘤最具希望的治療手段。但是,關(guān)于不同分化狀態(tài)細(xì)胞遷移的研究還較少。本實(shí)驗(yàn)旨在探討成神經(jīng)分化的BMSCs向干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)的遷移行為。
　　 方法：
　　 (1)采用Pe

2、rcoll密度梯度分離法分離BMSCs,并在體外擴(kuò)增培養(yǎng),通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測表面抗原,以及成脂、成骨誘導(dǎo)分化鑒定。
　　 (2)采用抗氧化劑丁羥基茴香醚(BHA)及bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化,首先用濃度為10 ng/ml的bFGF預(yù)誘導(dǎo)24 h,之后加入濃度為200μM的丁羥基茴香醚(BHA)和2％的二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)5 h,再用含有N2的H-DMEM維持48 h。觀察誘導(dǎo)分化過程中BMSCs

3、的形態(tài)變化,并且通過免疫熒光染色方法檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin、β-Ⅲ-tubulin和NSE的表達(dá)情況。
　　 (3)用Dunn chamber研究成神經(jīng)分化BMSCs向SCF的定向遷移行為,通過德國Leica AF6000活細(xì)胞工作站拍攝遷移圖像,應(yīng)用NIH Image J分析圖像,計(jì)算細(xì)胞的遷移速率、遷移效率以及遷移軌跡。并研究了PI3K抑制劑LY294002處理后BMSCs遷移行為的變化。
　　 結(jié)果：

4、
　　 (1)采用Percoll細(xì)胞分離液密度梯度法,成功分離培養(yǎng)出大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,免疫熒光染色顯示CD29、CD90、CD106呈陽性,CD34呈陰性,并且能夠分化成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。
　　 (2)用bFGF/BHA誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化,預(yù)誘導(dǎo)24 h,細(xì)胞形態(tài)變化較小,仍為長梭形；誘導(dǎo)5 h后細(xì)胞胞體出現(xiàn)回縮、有突觸伸出,形態(tài)改變較大,初步展現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征:維持培養(yǎng)18h,細(xì)胞分叉稍有增多；

5、維持48 h后,細(xì)胞分叉數(shù)目增多,并且產(chǎn)生二級分叉,類似于成熟神經(jīng)元的形態(tài)。對照組細(xì)胞無明顯的形態(tài)變化,免疫熒光染色顯示誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物nestin、β-Ⅲ-tubulin以及NSE。
　　 (3)Dtmn chamber遷移實(shí)驗(yàn)顯示,SCF誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移速率和遷移效率明顯高于對照組,表明SCF對BMSCs具有趨化作用。此外,分化不同狀態(tài)的BMSCs向SCF的趨化遷移程度也不同。另外,PI3K信號通路抑制劑LY