谷氨酸及Memantine對大鼠復(fù)合沖擊傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：近年來許多研究表明糖尿病性視網(wǎng)膜病變、青光眼等缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變及眼爆炸傷和視神經(jīng)半橫斷傷均伴有谷氨酸(Glu)介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的凋亡，并且證明Glu興奮毒性是觸發(fā)缺血缺氧性RGCs凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最主要因素，國外已有報(bào)導(dǎo)NMDA受體拮抗劑Memantine(MEM，美金剛)可明顯減少青光眼、視神經(jīng)半橫斷傷等引起的RGCs凋亡。沖擊傷后的視功能損害是否與Glu介導(dǎo)的RGCs凋亡相關(guān)，以及NMDA受體拮抗劑M

2、EM對沖擊傷后RGCs的作用尚未見報(bào)導(dǎo)。本研究通過采用大鼠沖擊傷、沖擊傷-缺氧復(fù)合傷模型觀察大鼠眼的病理組織學(xué)改變、視網(wǎng)膜內(nèi)Glu濃度變化、凋亡基因Caspase-3P20的表達(dá)及RGCs凋亡情況，以及NMDA受體拮抗劑MEM對大鼠眼沖擊傷后RGCs的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討眼沖擊傷的致傷機(jī)理，并為臨床治療提供新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：成年Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為四組：正常對照組(NGn=8)、單純沖擊傷組(BGn=24)

3、、復(fù)合沖擊傷治療對照組(HCGn=24)、復(fù)合沖擊傷MEM治療組(HTGn=24)。NG組大鼠不做任何處理，其余大鼠用BST-I型生物激波管致沖擊傷(超壓峰值482.7±1.2kPa，正壓持續(xù)時(shí)間約43.6ms)，HCG、HTG組大鼠致傷后立即放入12.5％低氧觀察艙內(nèi)6小時(shí)，自低氧艙取出后HCG組大鼠立即腹腔內(nèi)注射生理鹽水4ml/kg.d，HTG組大鼠立即腹腔內(nèi)注射MEM10mg/kg.d，各致傷組動(dòng)物分別于傷后1、3、5、7d活殺取

4、樣。光鏡、電鏡行眼的病理組織學(xué)觀察，高效液相法測定視網(wǎng)膜的Glu濃度，免疫組織化學(xué)方法檢測Caspase-3P20表達(dá)及TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：1.傷情1.1全身情況BG組部分大鼠煩躁不安，呼吸加快，死亡率約4％。HCG組部分大鼠口鼻紫紺、煩躁不安、呼吸急促，有的精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，死亡率約20％。 1.2眼部情況1.2.1光鏡BG組部分大鼠角膜上皮及基質(zhì)層輕度水腫，前房滲出率約33％；葡萄膜、視網(wǎng)膜血管

5、擴(kuò)張、血細(xì)胞淤積，偶見光感受器細(xì)胞外節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，部分內(nèi)核層細(xì)胞、RGCs空泡樣變，神經(jīng)纖維層水腫。 HCG組大鼠前房滲出率約66％，神經(jīng)纖維層高度水腫，光感受器細(xì)胞、內(nèi)核層細(xì)胞、RGCs改變較BG組明顯加重。 HTG組大鼠前房滲出率約28％，神經(jīng)纖維層水腫及光感受器細(xì)胞、RGCs改變較HCG組明顯減輕。 1.2.2透射電鏡BG組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹，光感受器細(xì)胞膜盤片層不整齊，內(nèi)、外核層細(xì)胞、RGCs水腫，胞

6、漿內(nèi)線粒體腫脹，嵴間隙變寬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，軸突腫脹變性，軸漿變淡，偶有髓鞘樣結(jié)構(gòu)形成。 HCG組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，周細(xì)胞腫脹空淡，光感受器細(xì)胞膜盤片層結(jié)構(gòu)破壞，甚至斷裂消失，內(nèi)、外核層細(xì)胞、RGCs水腫，細(xì)胞漿內(nèi)線粒體明顯腫脹，嵴間隙變寬，斷裂消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重度擴(kuò)張，大量脫顆粒，多量軸突腫脹變性髓鞘樣結(jié)構(gòu)形成。 HTG組光感受器細(xì)胞，內(nèi)、外核層細(xì)胞，RGCs及軸突的病理改變較HCG組明顯減輕。 2.視網(wǎng)膜內(nèi)Glu

7、濃度變化：正常大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)有一定生理濃度的Glu，為0.245±0.008ug/mg，BG、HCG、HTG組在傷后1天視網(wǎng)膜Glu濃度均顯著升高，3、5、7天有所回落，但仍明顯高于正常(P＜0.01)。在傷后1～5天HCG組大鼠視網(wǎng)膜Glu濃度明顯高于BG組，有顯著性差異(P＜0.05)；在1、3、7天HTG組大鼠視網(wǎng)膜Glu濃度則明顯低于HCG組，有顯著性差異(P＜0.05)。 3.Caspase-3P20免疫組織化學(xué)染色：免

8、疫組織化學(xué)染色Caspase-3P20表達(dá)陽性細(xì)胞主要為RGCs，內(nèi)核層偶見染色陽性細(xì)胞。在正常及傷后1天的視網(wǎng)膜未見Caspase-3P20染色陽性細(xì)胞。BG、HCG組均在傷后3天出現(xiàn)Caspase-3P20陽性表達(dá)，5天時(shí)明顯增多，7天時(shí)仍維持在高水平；HTG組亦是在傷后3天開始出現(xiàn)染色陽性細(xì)胞，5、7天時(shí)仍有陽性表達(dá)；但在每個(gè)相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)HCG組視網(wǎng)膜Caspase-3P20表達(dá)率明顯高于BG組，有非常顯著性差異(P＜0.01)；而

9、HTG組視網(wǎng)膜Caspase-3P20表達(dá)率則明顯低于HCG組，有非常顯著性差異(P＜0.01)。 4.TUNEL染色：TUNEL染色陽性細(xì)胞主要為RGCs，內(nèi)核層偶見染色陽性細(xì)胞。在正常及傷后1天的視網(wǎng)膜未見TUNEL染色陽性細(xì)胞。BG、HCG組均在傷后3天開始出現(xiàn)TUNEL染色陽性細(xì)胞，5天時(shí)明顯增多，7天時(shí)仍維持在高水平；HTG組亦在傷后3天開始出現(xiàn)TUNEL染色陽性細(xì)胞，5、7天時(shí)仍有陽性表達(dá)；但在每一相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)HCG組

10、視網(wǎng)膜TUNEL染色陽性率明顯高于BG組(P＜0.01)；而HTG組視網(wǎng)膜TUNEL染色陽性率則明顯低于HCG組(P＜0.01)。 5.相關(guān)性分析：視網(wǎng)膜Glu濃度、RGCs的Caspase-3P20陽性表達(dá)率、凋亡率之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩兩之間R2值均大于0.8，P＜0.01。 結(jié)論：1.沖擊傷可致大鼠血—房水屏障(BAB)破壞，葡萄膜、視網(wǎng)膜血循環(huán)障礙，光感受器細(xì)胞的損害及RGCs和軸突的變性。 2.各致

11、傷組大鼠視網(wǎng)膜Glu濃度在傷后1天即達(dá)峰值，顯著高于正常，提示沖擊傷后早期即啟動(dòng)了Glu興奮毒性機(jī)制。 3.各致傷組傷后RGCs均有Caspase-3P20的高表達(dá)，表明Glu啟動(dòng)的Caspase-3的活化可能與傷后RGCs凋亡有關(guān)。 4.各致傷組傷后均有TUNEL染色陽性的RGCs，提示Glu通過NMDA受體介導(dǎo)的RGCs凋亡可能是沖擊傷后視網(wǎng)膜損傷的一個(gè)重要因素。 5.HCG組眼部病理組織學(xué)改變、視網(wǎng)膜內(nèi)Gl