FoxP3 siRNA轉(zhuǎn)染慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞增強(qiáng)乙肝免疫的研究.pdf

1、目的：探討FoxP3 基因特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）對(duì)慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）患者外周血淋巴細(xì)胞FoxP3 表達(dá)的抑制作用；同時(shí)觀(guān)察干擾后對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響、對(duì)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 和IL-4、IL-10 分泌的調(diào)節(jié)及對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞的殺傷作用；最后探討干擾FoxP3 基因表達(dá)對(duì)T-bet 、GATA-3 表達(dá)的影響作用，從而研

2、究干擾FoxP3 基因的免疫激活作用以及其中的可能相關(guān)機(jī)制，為CHB 治療提供新思路。
　　 方法：1.電穿孔法將FoxP3 基因特異性siRNA 轉(zhuǎn)染CHB 患者外周血淋巴細(xì)胞，分別于24h, 48h, 72h 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time PCR）方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞FoxP3 mRNA 的表達(dá)變化，并于轉(zhuǎn)染后48h 用蛋白電泳方法（Western Blot）檢測(cè)淋巴細(xì)胞FoxP3 蛋白表達(dá)的變化。2

3、. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA ）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h 后培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-2 和IL-4、IL-10 分泌水平。3. CCK-8 試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染后淋巴細(xì)胞在24h、48h、72h 及96h 的增殖反應(yīng)；將干擾后淋巴細(xì)胞與HepG2.2.15 細(xì)胞共培養(yǎng)，用LDH 試劑盒檢測(cè)CTL 活性。4. Real time PCR 方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后淋

4、巴細(xì)胞T-bet 、GATA-3 mRNA 的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：1.與對(duì)照siRNA(co-siRNA)組、空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染FoxP3 特異性siRNA 后，在24h、48h 和72h 對(duì)FoxP3 mRNA 表達(dá)均有抑制作用，其中48h 這個(gè)時(shí)間點(diǎn)抑制作用最強(qiáng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異（p 值均<0.01），同時(shí)，F(xiàn)oxP3 蛋白表達(dá)在48h 也受到明顯的抑制。2.與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

5、組上清液IFN-γ、IL-2 和IL-4、IL-10 的檢測(cè)水平均具有顯著性差異（P 值均<0.05），其中對(duì)IFN-γ、IL-2 是促進(jìn)作用，對(duì)IL-4、IL-10 是抑制作用。3.與對(duì)照siRNA(co-siRNA)組、空白對(duì)照組相比，F(xiàn)oxP3 特異性siRNA 轉(zhuǎn)染24h 后，淋巴細(xì)胞開(kāi)始增殖，48h 增殖能力最強(qiáng)，72h、96h 增殖能力開(kāi)始逐漸下降；將干擾后48h 的淋巴細(xì)胞與HepG2.2.15 細(xì)胞以10：1、20：1

6、和40：1 效靶比共培養(yǎng)，在效靶比為40：1 時(shí)，CTL 活性最強(qiáng)；不同效靶比，CTL 活性不同，隨著效靶比增高，殺傷作用增強(qiáng)。4.與兩個(gè)對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染48h 后，淋巴細(xì)胞T-bet 、GATA-3 mRNA 的表達(dá)水平具有顯著性差異（p 值均<0.01），其中對(duì)T-bet 表達(dá)是促進(jìn)作用，對(duì)GATA-3 則相反。
　　 結(jié)論：利用FoxP3 特異性siRNA 在mRNA 水平抑制CHB 患者外周血淋巴細(xì)胞該基因的表達(dá)；誘導(dǎo)T