CTLA-4 siRNA轉染慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細胞增強乙肝免疫的研究.pdf

1、目的：探討慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血淋巴細胞細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）表達與血清HBV-DNA之間的相關關系；探討化學合成的小干擾RNA（RNA，siRNA）對CHB患者外周血淋巴細胞CTLA-4基因表達的抑制作用，同時觀察干擾后對IFN-γ、IL-2和IL-4分泌的調節(jié)，從而觀察干擾CTLA-4基因后的免疫激活作用，為CHB治療提供新思路。 方法：①用實時熒光定量PCR檢測39例CHB患者外周血淋巴細胞C

2、TLA-4 mRNA和血清中HBV-DNA的含量。②根據(jù)人淋巴細胞共刺激分子CTLA-4的基因序列，設計并合成3條含21個堿基的siRNA(siRNA1，siRNA2，siRNA3)及隨機陰性對照(siRNA-co)。用電穿孔法轉染30例CHB患者外周血淋巴細胞，分別于轉染后24h、48h和72h收集細胞，用實時熒光定量PCR方法檢測淋巴細胞CTLA-4 mRNA的表達，并于轉染后48h 用Western Blot檢測淋巴細胞CTLA-

3、4蛋白的表達，從三對siRNA中選出最有效的siRNA進入接下來的試驗。③將選出的siRNA轉入92例CHB患者外周血淋巴細胞中，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IFN-γ、IL-2和IL-4分泌。 結果：⑴CHB患者外周血淋巴細胞CTLA-4的表達與血清HBV-DNA呈正相關。⑵與陰性對照組相比，轉染siRNA 24h、48h和72h，三對siRNA對CTLA-4 mRNA均有抑制作用，統(tǒng)計學有顯著性差異（P<0.01）。

4、siRNA1、siRNA2和siRNA 3均在48h對CTLA-4 mRNA的抑制作用最強，明顯大于24h和72h（P<0.01）。其中siRNA1在48h對CTLA-4 mRNA的抑制效率最高，達（67.07±4.36）％。轉染48h三對siRNA對淋巴細胞CTLA-4蛋白表達均有抑制作用，且siRNA1的抑制作用最強。⑶與各對照組相比，實驗組上清液IFN-γ和IL-2的檢測水平具有顯著性差異（P<0.01)，而IL-4的檢測水平無顯