豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP4切割STAT2分子機(jī)制的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失的病毒性傳染病。研究發(fā)現(xiàn)PRRSV通過自身編碼的蛋白抑制機(jī)體的天然免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)免疫逃避，但目前關(guān)于PRRSV編碼的nsp4蛋白抑制JAK-STAT信號(hào)通路的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　本研究通過研究PRRSV編碼的nsp4與JAK-STAT信號(hào)通路之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)nsp4能切割關(guān)鍵信號(hào)分子STAT2。進(jìn)一步分析了ns

2、p4切割STAT2的氨基酸位點(diǎn)，探討nsp4切割STAT2在PRRSV調(diào)控天然免疫反應(yīng)中的作用。主要內(nèi)容如下:
　　1.PRRSV感染細(xì)胞后抑制ISGs的表達(dá)
　　通過相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PRRSV感染PAMs細(xì)胞和MARC-145細(xì)胞后顯著抑制IFN-α誘導(dǎo)的2'，5'-OAS，ISG15，ISG56和ISG60的mRNA水平;雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PRRSV感染MARC-145后可以顯著抑制IFN-α對(duì)ISRE-L

3、uc的激活。為篩選出抑制ISRE活性的蛋白，將PRRSV編碼的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒與熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒ISRE-Luc和pGL-4.74共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1a、nsp1b、nsp4、nsp11、nsp12，結(jié)構(gòu)蛋白GP3和N均能抑制IFN-α誘導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子活性，其中nsp4抑制效果顯著。
　　2.PRRSV編碼的nsp4蛋白依賴其絲氨酸蛋白酶活性抑制

4、IFN-α誘導(dǎo)的ISRE活性
　　將真核表達(dá)質(zhì)粒nsp4進(jìn)行倍比稀釋與熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒ISRE-Luc共轉(zhuǎn)染HEK-293T或3D4細(xì)胞，雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示在這兩種細(xì)胞上nsp4均能顯著抑制IFN-α誘導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子活性，并且呈明顯的劑量依賴;利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明nsp4抑制IFN-α誘導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子活性依賴其絲氨酸蛋白酶活性。
　　3.PRRSV編碼的nsp4蛋白切割STAT2位點(diǎn)為E719
　　本

5、研究發(fā)現(xiàn)超表達(dá)nsp4對(duì)STAT2蛋白的mRNA水平?jīng)]有影響，而切割JAK-STAT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白STAT2，且呈明顯的劑量依賴;本研究證明nsp4切割STAT2不依賴泛素-蛋白酶體途徑和細(xì)胞凋亡途徑，而是依賴于自身的絲氨酸蛋白酶活性，并鑒定出nsp4切割STAT2的位點(diǎn)為E719。PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后，Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性STAT2被降解，但是檢測(cè)不到切割條帶。
　　4.PRRSV編碼的ns

6、p4蛋白拮抗JAK-STAT信號(hào)通路
　　本研究將nsp4真核表達(dá)質(zhì)粒與STAT1和STAT2真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，通過Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRRSV編碼的nsp4蛋白切割STAT2之后，STAT1和STAT2的相互作用顯著減弱。將STAT2全長(zhǎng)或截短突變體與STAT1和IRF9共轉(zhuǎn)染，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR結(jié)果顯示只有全長(zhǎng)STAT2可以與STAT1和IRF9作用激活I(lǐng)SRE，誘導(dǎo)ISGs表達(dá)，截短的STA

7、T2不能激活I(lǐng)SRE活性和ISGs的表達(dá)，nsp4切割STAT2抑制了JAK-STAT信號(hào)通路的信號(hào)傳遞。
　　綜上所述，本研究首次揭示了PRRSV編碼的nsp4蛋白在拮抗JAK-STAT信號(hào)通路中的重要作用;發(fā)現(xiàn)PRRSV編碼的nsp4蛋白依賴其自身的絲氨酸蛋白酶活性切割JAK-STAT信號(hào)通路中重要信號(hào)分子STAT2蛋白，阻止信號(hào)向下游傳遞，抑制ISRE啟動(dòng)子活性，以及ISGs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí)鑒定出nsp4切割STAT2的位點(diǎn)