自噬和線粒體輔酶Q對膿毒癥大鼠心功能的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的膿毒癥大鼠體內(nèi)及體外急性分離心肌細胞的研究，旨在了解自噬在膿毒癥大鼠心功能障礙中的作用及功能變化。
　　方法:
　　1.自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠生存率的影響
　　將SD雄性大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為5組。
　　2.自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠心功能的影響
　　2.1 實驗動物模型及分組
　　將SD大鼠隨機分1

2、0組:對照4h、6h組，LPS4h、6h、8h、12h組，LPS+ Wortmannin4 h組，Wortmannin4 h組，LPS+ MitoQ6 h組，MitoQ6 h組，每組10只大鼠。
　　2.2 大鼠頸總動脈插管及數(shù)據(jù)記錄
　　各組大鼠在相應(yīng)時間點前30分鐘給10％水合氯醛0.3 ml/kg腹腔注射麻醉.
　　2.3 血漿樣本收集及心肌組織形態(tài)學檢查
　　左心室壓力測定后，腹主動脈留取血標本，分離血漿

3、置于-70℃冰箱中保存待檢。
　　2.4 血漿肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測
　　采用美國Beckman LX-20全自動生化分析儀檢測。
　　2.5 血漿及心肌組織中IL-1β、TNF-α、ROS含量檢測
　　采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，操作步驟按照試劑盒說明書進行。
　　2.6 心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測
　　采用BCA法測蛋白濃度，吸光

4、度法檢測Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。
　　2.7 心肌組織中LC3、GRP78蛋白的表達
　　采用Western blot法測定。
　　3.自噬通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解LPS所致心肌細胞收縮舒張功能障礙
　　3.1 心室肌細胞的分離
　　取健康雄性SD大鼠，腹腔注射肝素2500 U/kg，30 min后，腹腔注射10％水合氯醛0.4 ml/kg麻醉，將Langendorff灌流套管插入主動脈，酶解法分離

5、心室肌細胞，分離的心肌細胞在8h之內(nèi)使用。
　　3.2 大鼠心肌細胞收縮和舒張功能測定
　　采用可視化動緣探測系統(tǒng)(IonOptix)測定各組心肌細胞最大收縮幅度(Peakshortening，PS)、最大收縮速率(+dL/dt)、最大舒張速率(-dL/dt)。
　　3.3 大鼠心肌細胞舒張期鈣濃度及鈣瞬變的同步檢測
　　將心肌細胞負載鈣離子熒光探針Fluo-4/AM后采用IonOptix系統(tǒng)同步測定心肌細胞舒張

6、期鈣及鈣瞬變的變化。
　　3.4 心肌細胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測
　　采用BCA法測蛋白濃度，吸光度法檢測Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。
　　3.5 心肌細胞上清CK-MB、LDH含量檢測
　　取各組心肌細胞上清液，用化學比色法測得CK-MB、LDH含量。
　　3.6 心肌細胞內(nèi)ROS含量檢測
　　利用熒光探針2'，7'二氯氫化熒光素乙二脂(2'，7'-dichlorodihydro

7、fluoresceindiacetate，DCFH-DA)進行活性氧檢測，用熒光酶標儀檢測熒光強度反映細胞內(nèi)活性氧的含量。
　　3.7 心肌細胞中LC3、GRP78蛋白的表達
　　采用Western blot法。
　　結(jié)果:
　　1.自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠生存率的影響及一般表現(xiàn)
　　大鼠腹腔注射LPS后約1h后，出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、豎毛、大小便失禁、活動減少、進食、飲水減少等典型內(nèi)毒素血癥臨床癥狀，L

8、PS+ MitoQ組上述癥狀無減輕，LPS+ Wortmannin組癥狀更顯著，并出現(xiàn)血尿、血便癥狀。
　　2.自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠心功能的影響
　　2.1 各組大鼠血漿CK-MB、LDH含量變化
　　大鼠給LPS后6h出現(xiàn)血漿CK-MB、LDH含量的明顯升高與同時間點對照組比較差異有顯著性（均P＜0.05）。
　　2.2 各組大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的變化
　　大鼠給LPS后6

9、h出現(xiàn)Ca2+-Mg2+-ATP活力明顯下降與同時間點對照組比較差異有顯著性（F=3.049，P=0.016）。
　　2.3 各組大鼠在體心功能變化
　　LPS注射后6h大鼠出現(xiàn)心功能異常，表現(xiàn)為LVEDP明顯升高，LVSP、±dp/dtmax明顯降低。
　　2.4 各組大鼠心肌組織病理學改變
　　光鏡下，LPS6 h、8h、12h組、LPS+MitoQ6 h組和LPS+Wortmannin4 h組均出現(xiàn)明顯心肌

10、病理改變。
　　2.5 血漿及心肌組織中IL-1β、TNF-α、ROS含量變化
　　大鼠給LPS后4h出現(xiàn)血漿、心肌組織TNF-α明顯升高與同時間點對照組比較差異均有顯著性（均P＜0.05）。
　　大鼠給LPS后6h出現(xiàn)血漿、心肌組織IL-1β明顯升高與同時間點對照組比較差異均有顯著性（均P＜0.05）。
　　大鼠給LPS后6h出現(xiàn)血漿、心肌組織ROS明顯升高與同時間點對照組比較差異有顯著性（均P＜0.05）。<

11、br>　　2.6 心肌組織中LC3、GRP78表達量的變化
　　大鼠給LPS后6h出現(xiàn)LC3-Ⅱ表達量的明顯增加，與對照組比較有差異(F=10.408，P=0.001)，LPS12 h表達的量有下降趨勢。
　　3.自噬通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解LPS所致心肌細胞收縮舒張功能障礙
　　3.1 不同濃度LPS對心肌細胞自噬功能影響
　　隨著LPS濃度的增高，自噬標志物LC3-Ⅱ蛋白表達逐步增加，但隨著LPS濃度的進一步增

12、高，LC3-Ⅱ蛋白表達有下降趨勢。
　　3.2 Wortmannin對心肌細胞CK-MB、LDH、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響
　　LPS+ Wortmannin組CK-MB、LDH活性顯著高于LPS組，而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著低于LPS組，差異均有顯著性（均P＜0.05）。
　　3.3 Wortmannin對心肌細胞內(nèi)ROS含量的影響
　　LPS+Wortmannin組顯著高于LPS組，

13、差異有顯著性(F=63.278，P=0.000)，給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA，ROS含量有下降。
　　3.4 Wortmannin對心肌細胞收縮舒張功能的影響
　　LPS+Wortmannin組PS、±dL/dt顯著低于對照組，差異均有顯著性(均P＜0.05)，給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA，PS、±dL/dt有升高，與LPS+Wortmannin組比較差異均有顯著性（均P＜0.05）。
　　3.5 Wor

14、tmannin對心肌細胞內(nèi)鈣濃度的影響
　　LPS+ Wortmannin組舒張期鈣顯著高于LPS組，差異有顯著性(F=22.869，P=0.000)，而鈣瞬變顯著低于LPS組，差異有顯著性(F=92.834，P=0.000)。給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA，舒張期鈣有降低，鈣瞬變有升高，與LPS+ Wortmannin組比較差異均有顯著性（均P＜0.05）。
　　3.6 Wortmannin對心肌細胞GRP78表達的影

15、響
　　LPS+Wortmannin組GRP78表達水平顯著高于LPS組，差異有顯著性(F=5.886，P=0.001)。給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA，GRP78表達水平顯著低于LPS+Wortmannin組，差異有顯著性(F=5.886，P=0.043)。
　　3.7 MitoQ對心肌細胞CK-MB、LDH、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響
　　LPS組CK-MB、LDH活性顯著高于對照組，而Ca2+-M

16、g2+-ATP酶活性顯著低于對照組，差異均有顯著性（均P＜0.05）。
　　3.8 MitoQ對心肌細胞內(nèi)ROS含量的影響
　　LPS組顯著高于對照組，差異有顯著性(F=22.753，P=0.000)，給MitoQ干預(yù)LPS+ MitoQ組ROS含量明顯下降，與LPS組比較差異有顯著性(F=22.753，P=0.003)，但仍高于對照組，差異有顯著性(F=22.753，P=0.003)。
　　3.9 MitoQ對心肌細

17、胞LC3表達的影響
　　LPS組顯著高于對照組，差異有顯著性(F=15.019，P=0.000)。LPS+MitoQ組顯著低于LPS組，差異有顯著性(F=15.019，P=0.011)，但仍高于對照組，差異有顯著性(F=15.019，P=0.011)。
　　3.10 MitoQ對心肌細胞收縮舒張功能的影響
　　LPS組PS、±dL/dt顯著低于對照組，差異均有顯著性（均P＜0.05），LPS+MitoQ組PS、±dL/

18、dt有升高，但仍低于對照組，差異均有顯著性（均P＜0.05）。
　　3.11 MitoQ對心肌細胞內(nèi)鈣濃度的影響
　　LPS組舒張期鈣濃度明顯增加，而鈣瞬變幅度明顯降低。
　　結(jié)論:
　　1.抑制自噬降低膿毒癥大鼠生存率和生存時間，線粒體靶向抗氧化劑MitoQ對膿毒癥大鼠生存率和生存時間沒有影響。
　　2.線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可降低膿毒癥心肌組織自噬功能，對膿毒癥大鼠心功能障礙無保護作用。