神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分建立缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠心臟模型
　　研究背景:
　　糖尿病顯著增加心血管疾病的發(fā)生率和死亡率，循證醫(yī)學(xué)證明，約60％糖尿病患者死于心血管相關(guān)的并發(fā)癥。其中，冠心病是最主要死因，而缺血再灌注損傷在冠心病心肌損害過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，糖尿病容易致冠心病的具體發(fā)病機(jī)制不完全清楚。對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的模型來(lái)探討相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，探索最佳的治療方案。
　　目的:
　　建立缺血再

2、灌注損傷的糖尿病小鼠心臟模型。
　　方法:
　　(1)實(shí)驗(yàn)組小鼠高脂飼料喂養(yǎng)2周后，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素110mg/kg建立糖尿病小鼠模型，對(duì)照組小鼠普通飼料喂養(yǎng)并腹腔內(nèi)注射同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液。
　　(2)分別于建模前及建模8周時(shí)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度，分析糖尿病小鼠神經(jīng)病交情況。
　　(3)利用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)評(píng)估缺血再灌注損傷對(duì)糖尿病小鼠心功能的影響，記錄心功能的參

3、數(shù)。
　　結(jié)果:
　　(1)實(shí)驗(yàn)組糖尿病小鼠的血糖水平明顯高于對(duì)照組(28.81±4.67 vs.8.56±1.64mmol/L，P＜0.01)，并維持高水平至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　(2)實(shí)驗(yàn)組糖尿病小鼠感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯低于對(duì)照組(22.22±3.43 vs.31.29±2.48 m/s，P＜0.01)，提示糖尿病小鼠出現(xiàn)神經(jīng)性病變。
　　(3)經(jīng)歷缺血再灌注損傷后，糖尿病小鼠的LVSP、±dp/dt、HR、CF均

4、顯著下降，LVEDP升高，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　成功建立糖尿病小鼠模型，誘導(dǎo)出糖尿病神經(jīng)病變;建立糖尿病小鼠離體心臟Langendorff缺血再灌注損傷模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)建立研究基礎(chǔ)。
　　第二部分神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　研究背景:
　　在糖尿病患者中，由于存在神經(jīng)病變，因此即使發(fā)生了嚴(yán)重的心肌缺血，疼痛癥狀往往較輕微或不典型，易被誤診

5、或延誤病情。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是一種多肽物質(zhì)，能夠維持交感神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)的功能。已有研究證實(shí)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以改善糖尿病大鼠心臟神經(jīng)功能，降低室性心律失常的發(fā)生率。然而，神經(jīng)生長(zhǎng)因子能否改善缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠的心臟功能尚無(wú)相關(guān)研究。
　　目的:
　　將NGF轉(zhuǎn)基因療法應(yīng)用于糖尿病合并心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ停谄涓纳菩呐K神經(jīng)末梢功能的同時(shí)，觀(guān)察缺血心臟的功能改善程度。
　　方法:
　　利用第一部分建立的糖尿病

6、小鼠模型來(lái)探索神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的改善程度，具體包括:
　　(1)制備表達(dá)小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組腺病毒(Ad-NGF)。
　　(2) Western Blot實(shí)驗(yàn)研究糖尿病小鼠心臟NGF的表達(dá)水平。
　　(3)將重組腺病毒(Ad-NGF)轉(zhuǎn)染至心肌組織。
　　(4)建立離體心臟Langendorff灌流體系，觀(guān)察Ad-NGF對(duì)糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的影響，RM6240

7、生物信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)LVSP、LVEDP、HR、±dp/dt和CF。
　　(5)收集復(fù)灌期間的灌流液，測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的含量。
　　結(jié)果:
　　(1)重組腺病毒感染293T細(xì)胞后，Western Blot檢測(cè)到目的基因融合蛋白的表達(dá)，說(shuō)明重組腺病毒構(gòu)建成功。
　　(2)糖尿病小鼠心肌組織NGF表達(dá)顯著減少。轉(zhuǎn)染Ad-NGF后，NGF表達(dá)升高，說(shuō)明目的基因成功轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞并且表達(dá)提高。
　　

8、(3)與對(duì)照小鼠心臟相比，糖尿病小鼠心臟在缺血再灌注后心功能明顯下降:LVSP、±dp/dt、CF降低(P＜0.05)，LVEDP、LDH升高(P＜0.05)。
　　(4) Ad-NGF轉(zhuǎn)染組心臟在缺血再灌注后心功能得到明顯改善，其LVSP、±dp/dt、CF升高(P＜0.05)，LVEDP、LDH降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　表達(dá)小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組腺病毒可有效轉(zhuǎn)染至心肌組織，發(fā)揮改善糖尿病小鼠離體心臟缺

9、血再灌注損傷后心功能的作用。
　　第三部分 TRPV1途徑在神經(jīng)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的糖尿病心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制中的作用
　　研究背景:
　　TRPV1受體是已知的位于感覺(jué)神經(jīng)末梢上的感受器，在心臟上有大量表達(dá)。已有研究證實(shí)，激活TRPV1受體能改善小鼠心肌缺血再灌注損傷后的心功能。然而，NGF能否通過(guò)調(diào)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)TRPV1受體途徑改善糖尿病心臟缺血再灌注損傷后的心功能尚不清楚。
　　目的:
　　觀(guān)察Ad-

10、NGF對(duì)糖尿病動(dòng)物模型心臟感覺(jué)神經(jīng)末梢TRPV1受體及其神經(jīng)遞質(zhì)CGRP、SP釋放的影響，并進(jìn)一步明確NGF能否通過(guò)調(diào)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)TRPV1受體途徑改善糖尿病缺血再灌注損傷后的心功能。
　　方法:
　　(1) Western Blot方法研究糖尿病小鼠心臟組織中TRPV1受體的表達(dá)情況，并用ELISA法測(cè)定心肌組織中CGRP和SP的含量。
　　(2)將重組腺病毒(Ad-NGF)轉(zhuǎn)染至心肌組織。
　　(3)建立離體心

11、臟Langendorff灌流體系，缺血開(kāi)始前5分鐘往灌流液中分別加入選擇性CGRP受體拮抗劑CGRP8-37、選擇性SP受體拮抗劑RP67580或選擇性TRPV1受體激動(dòng)劑CAP，觀(guān)察上述物質(zhì)對(duì)糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的影響，以RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)LVSP、LVEDP、HR、±dp/dt和CF。
　　(4)收集灌流液，ELISA法檢測(cè)灌流液中CGRP和SP的含量。
　　結(jié)果:
　　(1)

12、與非糖尿病組比較，糖尿病組小鼠心肌組織中TRPV1受體表達(dá)減少(P＜0.05)，下游神經(jīng)遞質(zhì)CGRP及SP的含量下降(P＜0.05)。
　　(2)與未轉(zhuǎn)染組相比，Ad-NGF轉(zhuǎn)染組糖尿病小鼠心臟TRPV1受體表達(dá)增多(P＜0.05)，下游神經(jīng)遞質(zhì)CGRP的合成和釋放增加(P＜0.05)，SP的含量無(wú)顯著性變化(P＞0.05)。
　　(3)離體心臟Langendorff灌流系統(tǒng)加入CGRP8-37處理后，糖尿病小鼠的LVSP、