馬齒莧提取物對缺氧小鼠氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、近年來，由于西部高原經(jīng)濟(jì)建設(shè)及軍事斗爭的需要，將會有越來越多的人進(jìn)入高原。高原缺氧引起的健康損害及其預(yù)防措施的研究正越來越受到人們的關(guān)注。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，缺氧引起的氧自由基增加，是缺氧導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能損傷的重要原因之一。因此，服用能夠有效清除自由基、具有抗氧化作用的藥物，對于預(yù)防高原缺氧損傷可產(chǎn)生積極的作用。
　　 馬齒莧作為一味常用的藥食兩用中藥。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧提取物具有延長缺氧小鼠生存時(shí)間的

2、作用，其主要機(jī)制可能是通過提高缺氧組織HIF-1α含量，進(jìn)而促進(jìn)EPO的表達(dá)。另外，大量文獻(xiàn)表明，馬齒莧具有顯著的抗氧化活性。
　　 綜上所述，我們認(rèn)為馬齒莧提取物除了通過提高缺氧組織中HIF-1α的含量，調(diào)節(jié)下游低氧適應(yīng)基因來發(fā)揮其抗缺氧作用以外，馬齒莧的抗氧化功能可能也是其抗缺氧作用的重要組成部分。
　　 另外，原提取的馬齒莧抗缺氧有效部位化學(xué)成分復(fù)雜，不利于進(jìn)一步深入研究馬齒莧抗缺氧的作用機(jī)制，且不利于制定馬齒莧作

3、為抗缺氧藥物進(jìn)行生產(chǎn)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)?；谏鲜鰡栴}，我們進(jìn)行了如下研究：
　　 目的：
　　 1.在原有的提取組分基礎(chǔ)上進(jìn)一步對馬齒莧進(jìn)行精制提取，通過小鼠密閉缺氧實(shí)驗(yàn)篩選出有效的抗缺氧組分，并對其主要化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定。
　　 2.通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，了解馬齒莧提取物的抗氧化作用機(jī)制，及其對缺氧小鼠氧化損傷的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1.馬齒莧抗缺氧有效部位的進(jìn)一步分離提取
　　

4、1.1采用醇提水沉法和大孔樹脂層析法分離馬齒莧提取物的各個(gè)組分。
　　 1.2在確定馬齒莧醇提水沉沉淀組分為抗缺氧有效部位的基礎(chǔ)上，采用正向硅膠柱色譜層析法，用石油醚：乙酸乙酯的不同配比做洗脫劑.將馬齒莧沉淀部分分離成5個(gè)不同極性組分，采用薄層色譜法(TLC法)及氣相-質(zhì)譜(GC-MS)法，分析各組分的主要化學(xué)成分。
　　 1.3利用小鼠常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)觀察馬齒莧提取物的抗缺氧作用。
　　 2.馬齒莧提取物的體外

5、抗氧化能力測定
　　 2.1用紫外分光光度計(jì)檢測DPPH自由基與樣品結(jié)合后在517 nm波長的吸光度，分析不同濃度馬齒莧提取物清除DPPH自由基的能力；
　　 2.2用鄰二氮菲(Fenton)體系，通過紫外分光光度計(jì)檢測各樣品液在550nm波長下的吸光度，分析不同濃度馬齒莧提取物清除羥基自由基能力；
　　 2.3通過堿性條件下二甲基亞砜氧化產(chǎn)生氧自由基，利用紫外分光光度計(jì)測定550nm波長下各樣品的吸光度，分析不

6、同濃度馬齒莧提取物抑制超氧陰離子的能力；
　　 2.4將亞油酸和磷酸鹽緩沖液置于40℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中放置132h，使亞油酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，利用紫外分光光度計(jì)于500nm波長下測定各樣品的吸光度，分析不同濃度馬齒莧提取物抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化的能力；
　　 2.5在含不同濃度馬齒莧提取物的醇溶液中，分別加入K3Fe(CN)6，利用紫外分光光度計(jì)于700nm波長下測定各樣品的吸光度，分析馬齒莧提取物的還原能力。
　　

7、 3.馬齒莧提取物對缺氧小鼠氧化應(yīng)激損傷的緩解作用研究
　　 3.1實(shí)驗(yàn)動物分組及缺氧處理5-6周雄性ICR小鼠50只，體重(20±5)g，隨機(jī)分為常氧+生理鹽水處理組(空白對照組)、低氧+生理鹽水處理組、低氧+馬齒莧低劑量組(1g生藥/ml)、低氧+馬齒莧中劑量組(2g生藥/ml)、低氧+馬齒莧高劑量組(4g生藥/ml)。各組小鼠分別灌胃7天，于最后一次灌胃1h后放入常壓低氧艙暴露12h(O28％，N292％)，取出立即在冰上

8、斷頭處死，取小鼠肝臟、心臟、腦組織，于-80℃下保存。
　　 3.2采用試劑盒測定各組小鼠腦、心、肝組織中MDA的含量以及SOD和GSH-Px的活性
　　 4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，顯著性水平為P＜0.05，非常顯著性水平為P＜0.01。
　　 結(jié)果：
　　 1.馬齒莧抗缺氧有效部位的進(jìn)一

9、步分離提取
　　 1.1采用醇提水沉法和大孔樹脂層析法將馬齒莧分成了7個(gè)不同的組分：總提液組、上清液組、水洗脫液組、50％乙醇洗脫液組、95％乙醇洗脫液組、50％+95％乙醇洗脫液組、沉淀組，其中馬齒莧沉淀組能明顯延長常壓密閉缺氧小鼠的生存時(shí)間(P＜0.01)。
　　 1.2采用正相硅膠色譜柱層析法按照不同極性將馬齒莧沉淀分離成15∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶15個(gè)組分，其中2∶1、1∶1組分為低極性組分，兩組均

10、能明顯延長常壓密閉缺氧小鼠的生存時(shí)間(P＜0.01)。
　　 1.3馬齒莧低極性組分的主要化學(xué)成分為大量的萜類和不飽和脂肪酸類，及少量的甾體類。
　　 2.馬齒莧提取物的體外抗氧化能力測定
　　 2.1馬齒莧提取物濃度達(dá)到10mg/ml時(shí)，對DPPH自由基的清除率達(dá)到85.72％，馬齒莧提取物對DPPH自由基的半數(shù)清除率達(dá)到3mg/ml；；
　　 2.2馬齒莧提取物濃度達(dá)到5mg/ml時(shí)，對羥自由基的清除

11、率達(dá)到79.60％，馬齒莧提取物對羥自由基的半數(shù)清除率達(dá)到0.92g/ml；
　　 2.3馬齒莧提取物濃度達(dá)到5mg/ml時(shí)，對超氧陰離子的抑制率達(dá)到88.10％，馬齒莧提取物對超氧陰離子自由基的半數(shù)清除率達(dá)到1.03mg/ml；
　　 2.4馬齒莧提取物濃度達(dá)到10mg/ml時(shí)，對亞油酸脂質(zhì)過氧化的抑制率達(dá)到87.69％；
　　 2.5濃度為200μ g/mi時(shí)，馬齒莧的還原能力比對照物丁羥甲苯低12.37％。

12、
　　 3.第三部分馬齒莧提取物對缺氧小鼠氧化應(yīng)激損傷的緩解作用
　　 3.1與空白對照組(常氧+生理鹽水處理組)相比，低氧+生理鹽水處理組的小鼠腦，心，肝組織中MDA含量均顯著增高(P＜0.01)，SOD和GSH-Px活性均顯著降低(P＜0.01)；
　　 3.2與低氧+生理鹽水處理組對比，低氧+馬齒莧低劑量處理組(生藥濃度為1g/ml)的腦，心組織中MDA含量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是肝組織中MDA含量顯著降低

13、(P＜0.05)，低氧+馬齒莧中、高劑量處理組(生藥濃度為2和4g/ml)中，小鼠腦，心，肝組織中MDA含量都顯著降低(P＜0.01)；與空白對照組對比，低氧+馬齒莧各處理組的小鼠各組織MDA含量仍較高(P＜0.01)；
　　 3.3與低氧+生理鹽水處理組對比，低氧+馬齒莧低劑量處理組(生藥濃度為1g/ml)的小鼠腦和心組織中SOD、GSH-Px活性差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是肝組織中SOD、GSH-Px活性顯著提高(P＜0.05)

14、，低氧+馬齒莧中、高劑量處理組(生藥濃度為2和4g/ml)中，小鼠各組織中SOD、GSH-Px活性均顯著升高(P＜0.01);與空白對照組對比，低氧+馬齒莧各處理組的小鼠各組織SOD、GSH-Px活性仍較低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.馬齒莧提取物的低極性組分具有良好的抗缺氧活性；采用TLC法和GC-MS法鑒定馬齒莧低極性組分中含有大量的萜類和不飽和脂肪酸類，以及少量的甾體類；
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)顯

15、示馬齒莧低極性組分具有良好的清除DPPH、羥自由基、超氧陰離子能力及良好的抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化能力，但還原能力較弱。
　　 3.整體動物實(shí)驗(yàn)顯示馬齒莧提取物對缺氧小鼠的氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　 綜上所述，表明馬齒莧提取物可以提高缺氧小鼠體內(nèi)SOD、GSH-Px活性，清除氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成，進(jìn)而減輕了缺氧對組織細(xì)胞的損傷，即馬齒莧提取物的抗氧化功效可能是其能夠促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)之外提高