馬齒莧提取物對大鼠酒精性脂肪肝的預(yù)防作用及機制探討.pdf

1、脂肪變性是酒精性肝病最早和最常出現(xiàn)的損傷形式，長期酗酒者約90％以上可發(fā)展成脂肪肝。有研究者指出，脂肪肝并非一直以來人們所認為的是一種良性的疾病狀態(tài)，如果不加以重視，它可在短期內(nèi)發(fā)展為不可逆的肝損傷。近年來已有越來越多的證據(jù)表明，由于乙醇在肝細胞中的高能量代謝，肝細胞線粒體呼吸鏈功能亢進，使得細胞耗氧量增加，但是肝臟氧的運輸卻只是相對增加了很小的一部分，可導(dǎo)致中央靜脈處于相對缺氧的狀態(tài)，此時肝細胞對發(fā)生其他損傷變得更為敏感。而且，研究表

2、明發(fā)生酒精性脂肪肝(Alcoholicfattyliver，AFL)后，肝細胞腫大壓迫肝血竇造成竇隙變窄，使肝細胞缺血缺氧，長時間就會導(dǎo)致肝細胞變性和壞死，并促進肝纖維化的發(fā)生。已有調(diào)查資料證實，20％～40％的AFL患者可發(fā)展為肝纖維化，8％～20％患者可發(fā)展為肝硬化。由于酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化疾病的嚴重危害性和難治愈性，使得AFL的防治研究受到了廣泛的重視。
　　 然而，由于AFL的發(fā)病機制尚未完全明確，目前針對AFL

3、仍缺少有效的靶向治療手段。水飛薊素作為一種保肝藥物已應(yīng)用于臨床，其對于包括酒精性肝病在內(nèi)的很多肝臟疾病都有較好的臨床效果。但由于其水溶性差，口服后生物利用率低，使得其應(yīng)用受限，2010年Hepatology雜志發(fā)表的美國肝病學(xué)會與美國胃腸病學(xué)會聯(lián)合制定的酒精性肝病診斷與治療指南中指出，水飛薊素?zé)o論是對急性還是慢性酒精性肝病患者都沒有產(chǎn)生令人信服的效果，僅限用于酒精性肝病的臨床試驗。而對于其他防治AFL的藥物尚處于經(jīng)驗積累階段。因此，對抗

4、AFL藥物的研究和開發(fā)變得尤為重要。
　　 馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)為馬齒莧科馬齒莧屬植物，是我國衛(wèi)生部劃定的78種藥食同源的野生植物之一。我們課題組前期研究結(jié)果表明，馬齒莧提取物(ethanolextractfromPortulacaoleracea，EEPO)對缺氧小鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷有一定的保護作用，并對小鼠肝臟缺血再灌注損傷具有顯著的保護作用。且近年來的藥理研究表明，馬齒莧具有抗炎、抗氧化、降血脂

5、等功能，并對化學(xué)性、藥物性和急性酒精性肝損傷具有保護作用。以上研究提示，EEPO可能具有預(yù)防AFL的作用，因此，本課題對EEPO預(yù)防AFL的作用進行了觀察，并在此基礎(chǔ)上對其可能的作用機制進行了探討。
　　 研究目的：
　　 通過動物實驗觀察EEPO對AFL的預(yù)防作用，并在此基礎(chǔ)上探討EEPO抗AFL的作用機制，為將藥食兩用植物馬齒莧開發(fā)成抗AFL保健食品或藥物提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 一、大

6、鼠AFL模型的復(fù)制
　　 1、實驗動物分組及處理
　　 雄性Wistar大鼠20只(購自上海西普爾－必凱公司)，適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，按體重隨機分為對照組和模型組。模型組每日上午按0.5ml/100g劑量灌胃52°白酒一次，并給予高脂飼料，對照組灌胃生理鹽水，給予普通飼料。動物每晚八點之后禁食，至次日上午空腹灌胃后再給予飼料。每三天稱一次動物體重以調(diào)整灌胃體積。連續(xù)75天后，稱動物體重，用10％水合氯醛(0.3ml/100g)

7、麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置30min后以3000rpm離心20min，分離上層淡黃色血清，心臟灌流0.9％NaCl溶液，取全肝，并用濾紙吸干表面水分，稱重。取最大葉相同部位固定于10％中性甲醛溶液，用于制備石蠟切片。
　　 2、大鼠體重比的計算
　　 肝體重比=肝濕重(g)/體重(100g)
　　 3、肝脂含量的測定
　　 采用甘油三酯(triglycerides，TG)試劑盒提供的GPO-PAP酶法測

8、定。
　　 4、大鼠肝組織病理檢查
　　 常規(guī)HE染色：動物肝組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后切片、烤片、HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。
　　 5、大鼠血清TG、TC、ALT、AST的測定
　　 血清TG、總膽固醇(totalcholesterol，TC)分別采用試劑盒提供的GPO-PAP、CHOD-PAP酶法測定，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase，ALT)、

9、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartatcaminotransferase，AST)采用美國LACA血生化自動分析儀檢測。
　　 二、EEPO預(yù)防大鼠AFL的藥效觀察
　　 1、EEPO及陽性對照藥水飛薊素的制備
　　 EEPO由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院中醫(yī)科提供，溶于0.5％羧甲基纖維素鈉溶液中，配成低、中、高劑量的溶液，折合成生藥量分別為1.8g/ml、3.5g/ml、7.0g/ml。
　　 水飛薊素，購

10、自Sigma公司，溶于0.5％羧甲基纖維素鈉溶液(0.5％sodiumcarboxymethylcellulosesolution，0.5％CMCS)，配成20mg/ml的溶液。
　　 2、實驗動物分組及處理
　　 雄性Wistar大鼠(購自上海西普爾-必凱公司)56只，體重(160～180)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，按體重隨機分為正常對照組、AFL模型組、溶劑(0.5％CMCS)對照組、陽性對照藥水飛薊素組、EEPO低(1.

11、8g/100g)、中(3.5g/100g)、高(7.0g/100g)劑量給藥組，每組8只。
　　 所有大鼠于每晚八點開始禁食，次日早上按0.5ml/100g劑量，模型組、溶劑對照組、陽性對照組和各EEPO給藥組空腹灌胃52°白酒一次，并給予高脂飼料，正常對照組空腹灌胃生理鹽水，給予普通飼料。動物每晚禁食前等體積(1ml/100g)灌胃給藥。每三天稱一次動物體重以調(diào)整灌胃體積。連續(xù)75天，于末次給藥后禁食12h，不禁水。標本的采集

12、同第一部分。取最大葉相同部位固定于10％中性甲醛溶液，用于制備石蠟切片，取另一相同部位同樣固定于10％中性甲醛溶液，用于制備冰凍切片，其余肝組織分裝放入凍存管，置-80℃低溫冰箱保存。
　　 3、大鼠肝體重比的計算
　　 方法同第一部分。
　　 4、肝脂含量的測定
　　 方法同第一部分。
　　 5、大鼠肝組織病理檢查
　　 常規(guī)HE染色：方法同第一部分。
　　 脂肪染色：動物肝組織

13、經(jīng)固定、浸蔗糖去冰晶、OCT包埋后冰凍切片，切片厚度8μm，進行油紅O染色，光鏡下觀察肝組織脂肪沉積情況并據(jù)診斷標準進行分級。
　　 6、大鼠血清TG、TC、ALT、AST、GGT的測定
　　 血清TG、TC、ALT、AST的檢測方法同第一部分，血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase，GGT)亦采用美國LACA血生化自動分析儀檢測。
　　 三、EEPO預(yù)防AFL作用的機制探討
　　

14、 (一)動物實驗
　　 1、實驗動物分組及處理
　　 實驗動物分組及處理同第二部分。
　　 2、大鼠肝臟SREBP-1c、ACC、FAS、CPT-1、PPARa、HIF-1amRNA表達量的測定
　　 采用實時定量熒光PCR法測定大鼠肝臟內(nèi)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterolregulatoryelement-bindingproteins1c，SREBP-1c)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-Co

15、Acarboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase，F(xiàn)AS)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeProliferator-activatedreceptor，PPAR)a、肉堿軟脂酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitinepalmityltransferase，CPT-1)及缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainduciblefactor，HIF)-1amRNA的表達水平。
　　 3、大鼠肝臟ACC

16、和磷酸化ACC蛋白含量的測定
　　 Westernblot法測定各組大鼠肝臟內(nèi)ACC和磷酸化ACC的蛋白含量。
　　 (二)細胞實驗
　　 1、含藥血清的制備
　　 雄性Wistar大鼠，重約120g左右，按體重隨機分為對照組、EEPO組(7.0g生藥/100g)和水飛薊素組(200m/100g)，每日兩次分別灌胃同體積的0.5％CMCS、EEPO溶液和水飛薊素溶液。連續(xù)十次，于最后一次灌藥后1h(灌藥前

17、禁食不禁水12h)，腹主動脈采血，3000rpm離心20min，吸取上層血清，經(jīng)56℃30min滅活，無菌過濾后，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、Arnt1siRNA轉(zhuǎn)染細胞和EEPO干預(yù)
　　 按說明書將Arnt1siRNA轉(zhuǎn)染L02肝細胞后，加入不同體積的折合含生藥5g/ml的除菌EEPO含藥血清，對照組和陽性藥物組則加入0.5％CMCS和Silymarin含藥血清，使含藥血清的最終體積濃度百分比分別為1％、2％

18、、5％和10％，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。
　　 3、L02肝細胞ACC、FAS、SREBP-1cmRNA表達量的測定
　　 采用實時定量熒光PCR法測定L02肝細胞ARNT1、ACC、FAS、SREBP-1cmRNA的表達水平。
　　 四、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理
　　 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用t-檢驗；多組間采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD檢驗和SNK-q檢驗；

19、病理檢查采用等級資料的秩和檢驗。實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(x-±s)表示，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、大鼠AFL模型的復(fù)制
　　 1、大鼠體重比的比較
　　 模型組肝體重比較對照組升高(P＜0.05)。
　　 2、大鼠肝脂含量的比較
　　 模型組大鼠肝組織中TG含量較對照組明顯增加(P＜0.001；兩組間TG含量差異的95％CI為(1.61，2.53)mm

20、ol/l)。
　　 3、大鼠肝組織病理檢查結(jié)果
　　 光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變，結(jié)果顯示，正常對照組大鼠肝細胞排列規(guī)則，邊界清晰，結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝細胞可見彌漫性的脂質(zhì)空泡，大小不一，主要表現(xiàn)為大泡性脂變，細胞邊界不清。
　　 4、大鼠血清TG、TC、ALT、AST水平的比較
　　 模型組大鼠血清TG、TC水平均較對照組升高(P＜0.05)，血清酶ALT與對照組比亦升高(P＜0.05)，AST則

21、沒有差異。
　　 二、EEPO預(yù)防大鼠AFL的藥效觀察
　　 1、EEPO對AFL大鼠體重和肝體重比的影響
　　 實驗結(jié)束時，各組間大鼠體重均沒有差異(P＞0.05)。AFL模型組和溶劑對照組大鼠肝體重比沒有差異(P＞0.05)，但與正常對照組相比均有所升高(P＜0.001)。給予低、中、高劑量EEPO后，大鼠肝體重比值較模型組和溶劑對照組均有不同程度的降低(P＜0.001)，分別降低了8.7％、13.0％、15

22、.2％和12.5％、16.7％、18.8％；水飛薊素組大鼠肝體重比則較模型組和溶劑對照組分別降低了10.9％、14.6％(P＜0.001)；低、中、高劑量EEPO組與水飛薊素組間均無差異(P＞0.05)。
　　 2、EEPO對AFL大鼠肝脂含量的影響
　　 AFL模型組、溶劑對照組分別跟正常對照組相比，其大鼠肝組織中TG含量均有所升高(P＜0.001)，兩組之間則無差別(P＞0.05)。給予中高劑量EEPO干預(yù)的大鼠肝組

23、織中TG含量較模型組和溶劑對照組有不同程度的降低(P＜0.05)。水飛薊素組大鼠肝組織中TG含量較模型組和溶劑對照組也有一定程度的降低(P＜0.05)。
　　 3、大鼠肝組織病理檢查結(jié)果
　　 光鏡下觀察肝組織病理變化，HE染色結(jié)果顯示：正常對照組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)正常，無脂質(zhì)空泡。模型組則可見彌漫性的脂質(zhì)空泡，主要為小泡性脂肪性變(近中央靜脈處)，肝細胞腫大，胞漿內(nèi)擠滿了微小脂泡，核仍在中央。給予不同劑量馬齒莧提取物后脂變

24、情況有一定程度的減輕，水飛薊素對肝細胞脂變的影響與高劑量馬齒莧提取物組程度相近。油紅O脂肪染色結(jié)果亦表明，正常對照組大鼠肝細胞無紅色脂肪滴，模型組則可見彌漫性的紅色脂肪滴，肝細胞內(nèi)擠滿了紅色的微小脂滴。給予不同劑量馬齒莧提取物后紅色脂滴數(shù)量有一定程度的降低。油紅O染色結(jié)果同HE染色結(jié)果一致。
　　 4、EEPO對AFL大鼠血清TG、TC、ALT、AST、GGT的影響
　　 AFL模型組和溶劑對照組大鼠血清中TG、TC水平

25、較正常對照組均有升高(P＜0.001)，兩組間則無差別(P＞0.05)。預(yù)防性給予不同劑量水平的EEPO后，大鼠血清中TG水平較模型組和溶劑對照組有不同程度的降低(P＜0.001)，而且，高劑量EEPO組TG與正常對照組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；EEPO組跟模型組、溶劑對照組相比，血清TC同樣有一定程度的降低(跟模型組比P值分別為0.012、0.000、0.000；跟溶劑對照組比P值分別為0.006、0.000、0.000)；

26、EEPO三個劑量組間呈一定的劑量-效應(yīng)趨勢。水飛薊素組血清TG、TC水平較模型組和溶劑對照組也有所降低(P＜0.001)。各組間大鼠所測血清ALT、AST、GGT均無差別(P值分別為0.665、0.519、0.406，＞0.05)。
　　 三、馬齒莧提取物預(yù)防大鼠酒精性脂肪肝作用的機制探討
　　 (一)動物實驗
　　 1、EEPO對AFL大鼠肝臟ACC、FAS、SREBP-1c、CPT-1、PPARa、HIF-1

27、amRNA表達量的影響
　　 AFL模型組和溶劑對照組大鼠肝組織中ACC、FAS、SREBP-1cmRNA的表達量較正常對照組增加(P＜0.001)。給予不同劑量EEPO干預(yù)可不同程度地下調(diào)AFL大鼠肝組織中ACC、FAS、SREBP-1cmRNA的表達(其中低劑量EEPO組跟模型組比，P值分別為0.009、0.001、0.790；中劑量組EEPO組跟模型組比，P值分別為0.000、0.000、0.011；高劑量組EEPO組跟模

28、型組比，P值均為0.000)。水飛薊素組大鼠肝組織中ACC、FAS、SREBP-1cmRNA表達量也是下降的(P值分別為0.002、0.031、0.000)。所有組間大鼠肝臟CPT-1、PPARamRNA的表達量均無差別(P值分別為0.789、0.200,＞0.05)。HIF-1a在AFL模型組和溶劑對照組大鼠肝組織的mRNA表達比正常對照組高(P＜0.001)，給予低中高劑量EEPO干預(yù)可降低其表達(跟模型組比，P值分別為0.002、

29、0.000、0.000；跟溶劑對照組比，P值分別為0.018、0.000、0.000)。水飛薊素組跟模型組、溶劑對照組相比，HIF-1amRNA表達亦降低(P＜0.001)。
　　 2、EEPO對AFL大鼠肝臟ACC和磷酸化ACC蛋白表達量的影響
　　 AFL模型組和溶劑對照組大鼠肝組織中ACC和磷酸化ACC蛋白的表達量與正常對照組相比均明顯增加(P=0.001，ACC差異的95％CI分別為(1.30,3.92)、(1.

30、38，4.16)，p-ACC差異的95％CI分別為(0.15，0.74)、(0.17，0.77))，但兩組間大鼠肝組織ACC和磷酸化ACC蛋白的表達量均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。給予EEPO可不同程度地下調(diào)AFL大鼠肝組織中ACC和磷酸化ACC蛋白的表達(P＜0.05)，且呈劑量一效應(yīng)趨勢。
　　 (二)細胞實驗
　　 1、ARNT1siRNA轉(zhuǎn)染對L02肝細胞ARNT1mRNA表達的影響
　　 結(jié)果表明，轉(zhuǎn)

31、染ARNT1siRNA的L02肝細胞ARNT1mRNA的表達量較未轉(zhuǎn)染的對照組降低(P＜0.05)
　　 2、EEPO含藥血清對轉(zhuǎn)染ARNT1siRNA的L02肝細胞ACC、FAS、SREBP-1cmRNA表達的影響
　　 未轉(zhuǎn)染siRNA時，EEPO含藥血清干預(yù)組L02肝細胞ACC、FAS、SREBP-1cmRNA的表達量較0.5％CMCS對照組降低(P＜0.05)，且呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)趨勢；轉(zhuǎn)染ARNT1siRN

32、A后再給予EEPO含藥血清干預(yù)，L02肝細胞ACC、FAS、SREBP-1cmRNA的表達量同樣較0.5％CMCS對照組降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)趨勢；分別給予等劑量EEPO的siRNA轉(zhuǎn)染組與相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染對照組相比，ACC、FAS、SREBP-1cmRNA的表達量則無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、在飼喂高脂飼料的同時，每天定時定量給大鼠灌胃一定濃度的酒精，大鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)蓄

33、積，肝脂含量增加，肝體重比增大，血脂水平升高，表明大鼠AFL模型復(fù)制成功；
　　 2、EEPO可減少灌胃酒精聯(lián)合飼喂高脂飼料大鼠肝臟內(nèi)脂肪的蓄積，降低AFL大鼠肝脂含量，同時也可以降低其血脂水平，表明EEPO具有較好的預(yù)防AFL的作用；
　　 3、EEPO預(yù)防AFL的可能作用機制與其下調(diào)肝細胞中促進脂肪合成信號通路上的關(guān)鍵酶ACC、FAS以及重要調(diào)控因子SREBP－1c的mRNA表達，降低脂肪酸合成限速酶ACC及磷酸化A