脫氧核酶在逆轉(zhuǎn)具有MDR表型腫瘤細(xì)胞化療敏感性作用的研究.pdf

1、目的:
　　腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的一個(gè)主要機(jī)制是編碼P-糖蛋白的多藥耐藥基因MDR1。P-糖蛋白是一種能量依賴性的藥物輸出泵，能泵出癌細(xì)胞中的化療藥物。因基因療法具有較少的內(nèi)在毒性，所以我們認(rèn)為特異性抑制P-糖蛋白表達(dá)是一種很好的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的治療方法。目前，關(guān)于脫氧核酶逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性作用的研究很少。在這個(gè)課題中，我們合成了作用于翻譯起始密碼子AUG的硫代硫酸酯脫氧核酶，并轉(zhuǎn)染入具有MDR表型的乳腺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞中，同時(shí)也合成了

2、作用于相同基因區(qū)域的ASODN（反義寡核苷酸）和核糖酶，并與脫氧核酶做對(duì)比分析。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR，流式細(xì)胞術(shù)和Rh123滯留實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDR1mRNA和P-糖蛋白的變量，用MTT比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的化學(xué)敏感性。為了比較脫氧核酶與反義寡核苷酸及核糖酶逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的作用，我們將作用于翻譯起始密碼子的脫氧核酶，反義寡核苷酸及核糖酶分別轉(zhuǎn)染入藥物敏感細(xì)胞組MCF-7.K562及耐藥細(xì)胞組群MCF-7/ADM、K

3、562/ADR中，并與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，空白對(duì)照組及非特異性脫氧核酶，反義寡核苷酸及核糖酶做對(duì)比分析，通過檢測(cè)MDR1mRNA與P-糖蛋白變量及細(xì)胞內(nèi)Rh123滯留量評(píng)估脫氧核酶，反義寡核苷酸及核糖酶逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用及特異性。
　　結(jié)果:
　　1.在RT-PCR的分析中，MDR-1和β-actin的擴(kuò)增量分別為396bp和206bp。細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染入脫氧核酶，反義寡糖甘酸，核糖酶與mock空白對(duì)照36小時(shí)后，在5ug/ml濃

4、度下，與未被處理的細(xì)胞組群相比較，轉(zhuǎn)染脫氧核酶，反義寡糖核酸和核糖酶細(xì)胞的MDR1mRNA的表達(dá)量顯著減少。沒有特殊處理的對(duì)照細(xì)胞組群沒有觀察到任何變化。在所有的細(xì)胞組群中GSTπmRNA的表達(dá)量均無變化。
　　2.在流式細(xì)胞術(shù)定量測(cè)定P糖蛋白表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)中，脫氧核酶能在0.5μg/ml的濃度下抑制P-糖蛋白的表達(dá)，它對(duì)P-糖蛋白的抑制作用出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，并在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)達(dá)到峰值，并且脫氧核酶對(duì)P-糖蛋白的抑制作用好于核糖

5、酶質(zhì)粒和反義寡核苷酸。核糖酶質(zhì)粒對(duì)P-糖蛋白表達(dá)有較長(zhǎng)時(shí)間的抑制作用。
　　3.我們用細(xì)胞內(nèi)Rh123滯留量實(shí)驗(yàn)評(píng)估P糖蛋白的功能，結(jié)果顯示分別轉(zhuǎn)染脫氧核酶，反義寡核苷酸和核糖酶36小時(shí)后，在5μg/ml的濃度下，脫氧核酶組群細(xì)胞內(nèi)的Rh123滯留量顯著高于反義寡核苷酸和核糖酶細(xì)胞組群。這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中P-糖蛋白的泵出作用被抑制，尤其是在轉(zhuǎn)染脫氧核酶的細(xì)胞組群中。
　　4.在MTT藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到與轉(zhuǎn)染