細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶作為白血病治療靶點(diǎn)有效性的研究.pdf

1、該課題在于研究Chk1/2在白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)情況,評(píng)價(jià)Chk1/2與白血病發(fā)生的關(guān)系,同時(shí)設(shè)計(jì)合成Chk1/2反義寡核苷酸,研究Chk1/2反義寡核苷酸對(duì)藥物誘導(dǎo)下白血病細(xì)胞株及白血病病人骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡的影響,探討Chk1及Chk2作為白血病治療靶點(diǎn)的可能性和有效性. 第一部分:Chk1/2在白血病中的表達(dá)及意義;目的:探討Chk1/2在白血病中的表達(dá)及生物學(xué)意義.方法:用RT-PCR方法、共聚焦顯微鏡及免疫組織化學(xué)方法檢

2、測(cè)Chk1/2的mRNA和蛋白 在白血病細(xì)胞株K562及白血病病人骨髓細(xì)胞中的表達(dá).結(jié)果:Chk1/2在K562細(xì)胞及白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá), 白血病組與非白血病組細(xì)胞Chk1/2的mRNA水平及細(xì)胞核中蛋白水平表達(dá)無(wú)顯 著差異,而細(xì)胞漿中蛋白表達(dá)有顯著差異. 第二部分:藥物和放射對(duì)K562細(xì)胞周期影響的研究;目的:觀察化療藥物和放射對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響.方法:以不同劑量的藥物或放射處理細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處

3、理后不同時(shí)間細(xì)胞周 期變化.結(jié)果:不同的損傷刺激下,細(xì)胞周期變化呈現(xiàn)不同的規(guī)律.10μM的DDP作用30小時(shí)以S期阻滯最明顯,作用時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),S期細(xì)胞迅速下降,細(xì)胞凋亡率迅速增加.低劑量的ADM(0.17μM)以G2/M阻滯為主,隨著濃度增加,S期阻滯逐漸明顯,1.36μM的ADM作用48小時(shí)S期阻滯最明顯,作用時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),S期細(xì)胞迅速下降,細(xì)胞凋亡率迅速增加.第三部分:Chk1/2反義寡核苷酸增強(qiáng)藥物誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡的研究.

4、目的:觀察Chk1/2反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后對(duì)藥物誘導(dǎo)下凋亡的影響.方法:以脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染載體,轉(zhuǎn)染不同劑量的FITC標(biāo)記的寡核苷酸,熒光倒置顯 微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)最佳轉(zhuǎn)染條件時(shí)轉(zhuǎn)染率,用western blot 和共聚焦顯微鏡檢測(cè)最佳轉(zhuǎn)染條件下Chk1和Chk2反義寡核苷酸對(duì)Chk1和Chk2蛋白表達(dá)的影響.結(jié)果:Chk1反義寡核苷酸對(duì)K562細(xì)胞中Chk1蛋白表達(dá)有明顯抑制作用,Chk2反義寡 核苷酸對(duì)Chk

5、2蛋白有一定抑制作用.轉(zhuǎn)染Chk1/2反義寡核苷酸可明顯增加DDP 誘導(dǎo)下K562細(xì)胞凋亡率,Chk1和Chk2聯(lián)合轉(zhuǎn)染作用優(yōu)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染.第四部分:Chk1/2反義寡核苷酸增強(qiáng)藥物誘導(dǎo)的原代白血病細(xì)胞凋亡的研究.目的:評(píng)價(jià)Chk1/2反義寡核苷酸對(duì)DDP誘導(dǎo)的白血病原代細(xì)胞凋亡的影響.方法:選擇一例診斷明確的白血病作研究對(duì)象,分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,用含10﹪胎牛 血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng).用RT-PCR方法、免疫組化及western bl

6、ot方法檢 測(cè)Chk1和Chk2的表達(dá).用不同濃度的DDP處理原代細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)處 理不同時(shí)間后細(xì)胞周期的變化.按第三部分介紹的方法分組處理,用AnnexinV及PI法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率.結(jié)果:在被檢測(cè)的一例原代細(xì)胞中,Chk1及Chk2的mRNA和蛋白表達(dá)均陽(yáng)性,但免疫 組化發(fā)現(xiàn)Chk1在細(xì)胞漿和胞核中均為陽(yáng)性表達(dá),但Chk2僅在胞漿中弱陽(yáng)性表 達(dá),在胞核中表達(dá)為陰性.10μM的DDP處理細(xì)胞以G1期阻滯為主,作用時(shí)間 延長(zhǎng)出現(xiàn)

7、短暫的S期阻滯.轉(zhuǎn)染Chk1反義寡核苷酸可明顯增加DDP誘導(dǎo)下原 代細(xì)胞凋亡率,但轉(zhuǎn)染Chk2反義寡核苷酸未能明顯增加DDP誘導(dǎo)原代細(xì)胞凋 亡率,Chk1和Chk2聯(lián)合轉(zhuǎn)染作用不優(yōu)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染CHk1反義寡核苷酸.第五部分:秋水仙胺和長(zhǎng)春新堿對(duì)K562細(xì)胞plk1和γ-tubulin表達(dá)影響的研究;目的:研究秋水仙胺和長(zhǎng)春新堿對(duì)K562細(xì)胞plk1和γ-tubulin表達(dá)影響及plk1和 γ-tubulin的關(guān)系.方法:采用western