β-欖香烯對白血病K562細胞周期及細胞凋亡的影響及其機制探討.pdf

1、[目的] 欖香烯是從中藥莪術(shù)中提取的抗癌新藥，其有效成分為β-欖香烯。β-欖香烯(β-elemene，β-ELE)主要具有直接抗腫瘤、抗氧化、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、抗腫瘤免疫、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用。β-欖香烯對多種腫瘤細胞均有抑制作用，是一種非細胞毒性抗腫瘤藥物。由于其低毒、高效和廣譜等優(yōu)點，被廣泛用于治療多種腫瘤。P21WAF1基因是細胞周期素依賴激酶抑制因子，是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細胞周期素依賴激酶抑制因子，幾乎可與每一個

2、細胞周期素-細胞周期素依賴激酶復(fù)合物結(jié)合，從而使細胞周期停滯。凋亡抑制基因Survivin表達的蛋白是凋亡抑制蛋白家族的一員。Survivin基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子之一，主要通過間接或直接抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7的活性而發(fā)揮抗凋亡作用。研究表明，Survivin表達于人的胚胎、胸腺組織和幾乎所有人類常見惡性腫瘤組織，而在正常成人組織和終末分化的組織內(nèi)檢測不到。所以本研究選用人慢性髓原白血病

3、細胞株K562細胞為研究對象，P21WAF1、Survivin基因作為觀察指標(biāo)，擬觀察β-欖香烯對K562細胞的增殖抑制、細胞周期及細胞凋亡作用，探討其相關(guān)的可能作用機制。 [方法] (1)體外培養(yǎng)白血病細胞株K562細胞。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。 (2)利用MTT法、細胞形態(tài)學(xué)法觀察β-欖香烯對體外培養(yǎng)的K562細胞的增殖抑制作用，找出最佳藥物作用濃度及作用時間，并設(shè)不加β-欖香烯組作為對照組。

4、 (3)利用流式細胞儀技術(shù)、RT-PCR技術(shù)觀察β-欖香烯對體外培養(yǎng)的K562細胞的細胞周期的影響。 (1)應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)、Hoeehest33258/P1熒光染色法、RT-PCR技術(shù))檢測β-欖香烯對體外培養(yǎng)的K562細胞的凋亡影響。 [結(jié)果] (1)在β-欖香烯終濃度為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml作用24h、48h及72h后，β-欖香烯抑制細胞增殖作用逐漸增加，與對照組相

5、比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。24h、48h、72h的IC50分別是34.0±0.5μg/ml、21.0±0.8μg/ml、18.0±0.6μg/ml。細胞形態(tài)學(xué)觀察顯示：在β-欖香烯終濃度為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和50μg/ml作用24h、48h及72h后，β-欖香烯可抑制K562細胞的增殖，K562細胞的活細胞數(shù)隨著β-欖香烯濃度的增加及培養(yǎng)時間的延長，其活細胞數(shù)逐漸減少。

6、(2)流式細胞技術(shù)顯示：β-欖香烯10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和40μg/ml作用于K562細胞24h，48h后，K562細胞阻滯于G1期，G1期細胞百分比增加，并伴S期細胞百分比明顯下降，呈劑量、時間依賴性，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)G2期細胞百分比無明顯變化，與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。RT-PCR測定不同濃度的β-欖香烯作用于K562細胞后P21WAF1mRNA的表達

7、，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，其表達逐漸增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 (3)流式細胞技術(shù)顯示：β-欖香烯10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和40μg/ml作用于K562細胞24h，48h后，在G0/G1期前，可見明顯的亞二倍體(凋亡峰)，其凋亡率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Hoechest33258/PI免疫熒光技術(shù)顯示10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和4

8、0μg/mlβ-欖香烯培養(yǎng)K562細胞24h和48h，凋亡細胞數(shù)目明顯增多，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。RT-PCR測定不同濃度的β-欖香烯作用于K562細胞后SurvivnmRNA的表達，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，表達水平逐漸下降，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01) (4)兩因素相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：P21WAF1mRNA的表達與SurvivinmRNA表達下降，呈劑量依賴型，與對照組相比差異具

9、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 (4)終濃度為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/mlβ-欖香烯培養(yǎng)K562細胞48h后下調(diào)K562細胞SurvivinmRNA和上調(diào)P21WAF1mRNA的表達，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 [結(jié)論] (1)β-欖香烯有抑制K562細胞增殖的作用，且呈劑量、時間依賴性。 (2)β-欖香烯能夠阻止細胞K562細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換。