β-欖香烯對(duì)白血病K562細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、[目的] 欖香烯是從中藥莪術(shù)中提取的抗癌新藥，其有效成分為β-欖香烯。β-欖香烯(β-elemene，β-ELE)主要具有直接抗腫瘤、抗氧化、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、抗腫瘤免疫、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用。β-欖香烯對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，是一種非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物。由于其低毒、高效和廣譜等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于治療多種腫瘤。P21WAF1基因是細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子，是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子，幾乎可與每一個(gè)

2、細(xì)胞周期素-細(xì)胞周期素依賴激酶復(fù)合物結(jié)合，從而使細(xì)胞周期停滯。凋亡抑制基因Survivin表達(dá)的蛋白是凋亡抑制蛋白家族的一員。Survivin基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，主要通過間接或直接抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7的活性而發(fā)揮抗凋亡作用。研究表明，Survivin表達(dá)于人的胚胎、胸腺組織和幾乎所有人類常見惡性腫瘤組織，而在正常成人組織和終末分化的組織內(nèi)檢測(cè)不到。所以本研究選用人慢性髓原白血病

3、細(xì)胞株K562細(xì)胞為研究對(duì)象，P21WAF1、Survivin基因作為觀察指標(biāo)，擬觀察β-欖香烯對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡作用，探討其相關(guān)的可能作用機(jī)制。 [方法] (1)體外培養(yǎng)白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。 (2)利用MTT法、細(xì)胞形態(tài)學(xué)法觀察β-欖香烯對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞的增殖抑制作用，找出最佳藥物作用濃度及作用時(shí)間，并設(shè)不加β-欖香烯組作為對(duì)照組。

4、 (3)利用流式細(xì)胞儀技術(shù)、RT-PCR技術(shù)觀察β-欖香烯對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響。 (1)應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)、Hoeehest33258/P1熒光染色法、RT-PCR技術(shù))檢測(cè)β-欖香烯對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞的凋亡影響。 [結(jié)果] (1)在β-欖香烯終濃度為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml作用24h、48h及72h后，β-欖香烯抑制細(xì)胞增殖作用逐漸增加，與對(duì)照組相

5、比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。24h、48h、72h的IC50分別是34.0±0.5μg/ml、21.0±0.8μg/ml、18.0±0.6μg/ml。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示：在β-欖香烯終濃度為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和50μg/ml作用24h、48h及72h后，β-欖香烯可抑制K562細(xì)胞的增殖，K562細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)隨著β-欖香烯濃度的增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其活細(xì)胞數(shù)逐漸減少。

6、(2)流式細(xì)胞技術(shù)顯示：β-欖香烯10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和40μg/ml作用于K562細(xì)胞24h，48h后，K562細(xì)胞阻滯于G1期，G1期細(xì)胞百分比增加，并伴S期細(xì)胞百分比明顯下降，呈劑量、時(shí)間依賴性，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)G2期細(xì)胞百分比無明顯變化，與對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。RT-PCR測(cè)定不同濃度的β-欖香烯作用于K562細(xì)胞后P21WAF1mRNA的表達(dá)

7、，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，其表達(dá)逐漸增加，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 (3)流式細(xì)胞技術(shù)顯示：β-欖香烯10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和40μg/ml作用于K562細(xì)胞24h，48h后，在G0/G1期前，可見明顯的亞二倍體(凋亡峰)，其凋亡率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Hoechest33258/PI免疫熒光技術(shù)顯示10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和4

8、0μg/mlβ-欖香烯培養(yǎng)K562細(xì)胞24h和48h，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。RT-PCR測(cè)定不同濃度的β-欖香烯作用于K562細(xì)胞后SurvivnmRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，表達(dá)水平逐漸下降，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) (4)兩因素相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：P21WAF1mRNA的表達(dá)與SurvivinmRNA表達(dá)下降，呈劑量依賴型，與對(duì)照組相比差異具

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 (4)終濃度為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/mlβ-欖香烯培養(yǎng)K562細(xì)胞48h后下調(diào)K562細(xì)胞SurvivinmRNA和上調(diào)P21WAF1mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 [結(jié)論] (1)β-欖香烯有抑制K562細(xì)胞增殖的作用，且呈劑量、時(shí)間依賴性。 (2)β-欖香烯能夠阻止細(xì)胞K562細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換。