BRD7基因在白血病細胞中的表達、SNP分析及其對細胞周期和細胞凋亡的影響.pdf

1、【研究背景】 白血病是造血干細胞惡性克隆性疾病，是青少年常見惡性腫瘤之一。近年來，其發(fā)病率呈增加趨勢，從分子水平闡明白血病的發(fā)病機制對白血病的防治具有十分重要的意義。白血病的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多事件累積的結(jié)果，其過程涉及到許多瘤基因的激活和/或抑瘤基因的失活。原癌基因活化致癌的經(jīng)典范例是慢性粒細胞性白血病(CML)特征性的融合基因bcr-abl{由Ph染色體(Phi 1adephiachromosome)即t(9:22)(q3

2、4：q11)形成)，其融合的mRNA編碼具有高酪氨酸激酶活性的蛋白p210，最終導致細胞癌變。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)許多基因異常與白血病結(jié)伴而行，如基因突變、缺失、插入、過表達或/和功能失活等等。在這些基因中，有些基因在白血病與實體瘤之間呈現(xiàn)相似的特征如RAS、MYC、p16，有些則表現(xiàn)出不同的表達模式和作用機制。約60％的實體瘤含p53基因突變，它是p53在實體瘤中低表達和抑瘤功能失活的主要原因，而在大多數(shù)白血病中p53基因的表

3、達升高，但其突變發(fā)生率低(<20％)，其功能失活也可能與自身突變關系不大。盡管許多基因在白血病發(fā)病中的作用及其機制已初步明確，但所有的基因異常仍不能解釋全部白血病的發(fā)生機制，因此，尋找鑒定新的白血病相關瘤基因或抑瘤基因，并研究其生物學功能已成為當今白血病研究領域的熱點之一。 BRD7基因是我校腫瘤研究所分子遺傳室通過cDNA代表性差異分析方法新近克隆的鼻咽癌侯選抑癌基因，Genbank登錄號AF152604。該基因cDNA全長2

4、317bp，開放閱讀框(ORF)含651個氨基酸，定位于染色體16q12.1-12.2區(qū)。對BRD7基因的前期研究顯示BRD7在多數(shù)鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞系HNE1中表達下調(diào)，將該基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HNEl細胞后，發(fā)現(xiàn)BRD7具有抑制鼻咽癌細胞生長的功能，并通過Ras/MEK/ERK和Rb/E2F兩條通路影響細胞周期進程，使細胞停滯于G0/G1期。同時研究發(fā)現(xiàn)，BRD7蛋白在HNE1細胞定位于胞核，并能與核轉(zhuǎn)錄因子E1B-AP5、IRF2發(fā)生

5、交互作用，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。 【方法】 本研究將采用RT-PCR、免疫組織化學染色、Western blot等方法檢測人類不同類型急性白血病和白血病細胞系中BRD7的表達，分析BRD7表達與急性白血病病人臨床特征的相關性；應用PCR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和直接測序法檢測BRD7基因點突變或單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以進一步探討B(tài)RD7基因的遺傳變異與急性白血病發(fā)生的聯(lián)系：通過電轉(zhuǎn)染建立瞬時或穩(wěn)定表達BRD7基因的白血

6、病細胞系K562，并借助熒光蛋白(GFP)標志及流式細胞術分析BRD7基因?qū)毎芷诤偷蛲龅挠绊憽?【結(jié)果】 第一部分BRD7基因在白血病細胞中的表達及臨床意義 1.BRD7基因在白血病病人中的表達 52例急性白血病患者和32例正常對照的骨髓單個核細胞的總RNA經(jīng)RT-PCR后均擴增出一條259bp的目的cDNA片段，提示白血病細胞和正常骨髓單個核細胞均表達BRD7。與內(nèi)參GAPDH相比，急性淋巴細胞白血

7、病患者和急性非淋巴細胞白血病患者之間BRD7的相對表達量無明顯差異(P>0.05)，但病例組BRD7的相對表達量均高于正常對照組，兩兩比較有顯著性差異(t=3.672 P=0.001；t=2.148 P=0.037)。 2.BRD7蛋白在白血病病人中的表達 利用免疫組織化學SP法檢測了7例急性白血病患者和3例正常骨髓對照的骨髓細胞涂片，結(jié)果顯示在急性白血病患者的骨髓單個核細胞中BRD7陽性表達細胞百分率較高。 3

8、.BRD7基因與白血病患者白細胞和血小板數(shù)的相關性 經(jīng)Kenda11’s tau-b相關分析，結(jié)果顯示52例急性白血病患者BRD7基因的表達水平與其外周血白細胞數(shù)無明顯相關性(r=0.086，P=0.376)；與外周血血小板數(shù)亦無明顯相關性(r=0.011，P=0.912)。 4.BRD7基因在血液系惡性腫瘤細胞系中的表達 利用RT-PCR檢測血液系惡性腫瘤細胞系BRD7 mRNA的表達，結(jié)果顯示人類白血病細胞系

9、K562、HL-60和Jurkat細胞、人多發(fā)性骨髓瘤細胞株KM3、人非何杰金淋巴瘤細胞系Raji和人永生化的正常淋巴細胞B958均明確表達BRD7，但BRD7基因在K562細胞呈低表達。 5.BRD7蛋白在血液系惡性腫瘤細胞系中的表達 在人類白血病細胞系K562、HL-60和Jurkat細胞、人多發(fā)性骨髓瘤細胞株KM3、人非何杰金淋巴瘤細胞系Raji和人永生化的正常淋巴細胞B958中均存在BRD7蛋白的表達，但在K56

10、2細胞BRD7表達水平相對較低。 第二部分 BRD7單核苷酸多態(tài)性分析 1.PCR-SSCP初步篩選BRD7基因點突變 在30例正常人對照、52例急性白血病患者及30例正常骨髓對照的取樣中發(fā)現(xiàn)部分樣品擴增的基因片段在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有異常遷移現(xiàn)象，提示BRD7基因的第440～840位堿基可能存在突變或多態(tài)性。 2.DNA序列分析鑒定BRD7 SNP的基因型 DNA測序法成功地完成了BRD7等位

11、基因分型。在BRD7基因編碼區(qū)(440～840bp)發(fā)現(xiàn)了3個cSNP(coding region SNP)，即C657A、C495T和A737G，其中C657A顛換導致其編碼蛋白的第181位氨基酸由天門冬酰胺替換為賴氨酸；C495T和A737G多態(tài)性偶聯(lián)發(fā)生，前者為同義cSNP，后者使得編碼蛋白的第208位氨基酸由谷氨酸置換為甘氨酸。 3.BRD7 SNP在白血病和對照中的基因型 分布兩組中BRD7基因3個SNP位點的

12、基因型均有3種，即純合子突變型、雜合子突變型和正常型。A737G基因型頻率急性白血病組中為從：11.5％， AG：32.7％，GG：55.8％，A和G等位基因頻率分別為27.9％和72.1％；對照組中為從：38.4％，AG：28.3％，GG：33.3％，A和G等位基因頻率分別為53.4％和46.6％。兩組中A737G多態(tài)性的基因型頻率和等位--基因頻率均存在顯著性差異(X2=25.76，P<0.01)。危險性分析表明，基因型GG和AG的

13、相對危險度分別為5.33和5.86(OR值為1.12和1.23，95％置信區(qū)間分別為1.02～1.23和0.55～2.77)。C495T與A737G偶聯(lián)，基因型頻率及其分布同A737G。C657A多態(tài)性的基因頻率在病例和對照中無顯著性差異。 4.在白血病中A737G三種基因型 BRD7 mRNA表達的比較在急性白血病中，BRD7mRNA相對內(nèi)參GAPDH的表達量以737GG基因型最高，為0.512±0.192，737AG

14、型最低，為0.467±0.108，但三者間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 第三部分 BRD7對白血病細胞系K562細胞周期和凋亡的影響 1.BRD7在K562細胞中的亞細胞定位 將pEGFP-C2/BRD7表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染白血病細胞株K562細胞，利用其表達的綠色熒光蛋白(GFP)介導亞細胞定位，結(jié)果顯示在K562細胞中BRD7蛋白定位于細胞核，呈細點狀、條索狀分布，相對均勻，與染色質(zhì)的分布存在一定程度的相似

15、性。 2.BRD7對白血病細胞系K562細胞周期和凋亡的影響 分別將pEGFP-C2/BRD7表達質(zhì)粒和pEGFP-C2空白載體瞬時轉(zhuǎn)染白血病細胞系K562，通過流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，在K562細胞系中BRD7既能部分阻滯細胞周期GO/G1→S期的進程，又具有明顯的細胞凋亡始動功能。 【結(jié)論】 1.急性白血病病人和正常骨髓對照的骨髓單個核細胞均表達BRD7，且該基因在急性白血病細胞中表達上調(diào)。 2.

16、BRD7基因參與了急性白血病的發(fā)病過程，但BRD7基因mRNA的表達水平與急性白血病患者初治時外周血白細胞計數(shù)和血小板計數(shù)無相關性。 3.血液系惡性腫瘤細胞系K562、HL一60、Jlwkat、KM3、Raji和永生化的正常淋巴細胞B958均表達BRD7，其中K562細胞BRD7呈低表達。 4.BRD7基因編碼區(qū)(440～840bp)存在3個SNPs(C657A、C495T和A737G)，其中C450T和A737C偶聯(lián)，