BRD7基因在白血病細(xì)胞中的表達(dá)、SNP分析及其對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、【研究背景】 白血病是造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，是青少年常見(jiàn)惡性腫瘤之一。近年來(lái)，其發(fā)病率呈增加趨勢(shì)，從分子水平闡明白血病的發(fā)病機(jī)制對(duì)白血病的防治具有十分重要的意義。白血病的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多事件累積的結(jié)果，其過(guò)程涉及到許多瘤基因的激活和/或抑瘤基因的失活。原癌基因活化致癌的經(jīng)典范例是慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)特征性的融合基因bcr-abl{由Ph染色體(Phi 1adephiachromosome)即t(9:22)(q3

2、4：q11)形成)，其融合的mRNA編碼具有高酪氨酸激酶活性的蛋白p210，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)許多基因異常與白血病結(jié)伴而行，如基因突變、缺失、插入、過(guò)表達(dá)或/和功能失活等等。在這些基因中，有些基因在白血病與實(shí)體瘤之間呈現(xiàn)相似的特征如RAS、MYC、p16，有些則表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式和作用機(jī)制。約60％的實(shí)體瘤含p53基因突變，它是p53在實(shí)體瘤中低表達(dá)和抑瘤功能失活的主要原因，而在大多數(shù)白血病中p53基因的表

3、達(dá)升高，但其突變發(fā)生率低(<20％)，其功能失活也可能與自身突變關(guān)系不大。盡管許多基因在白血病發(fā)病中的作用及其機(jī)制已初步明確，但所有的基因異常仍不能解釋全部白血病的發(fā)生機(jī)制，因此，尋找鑒定新的白血病相關(guān)瘤基因或抑瘤基因，并研究其生物學(xué)功能已成為當(dāng)今白血病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 BRD7基因是我校腫瘤研究所分子遺傳室通過(guò)cDNA代表性差異分析方法新近克隆的鼻咽癌侯選抑癌基因，Genbank登錄號(hào)AF152604。該基因cDNA全長(zhǎng)2

4、317bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)含651個(gè)氨基酸，定位于染色體16q12.1-12.2區(qū)。對(duì)BRD7基因的前期研究顯示BRD7在多數(shù)鼻咽癌組織及鼻咽癌細(xì)胞系HNE1中表達(dá)下調(diào)，將該基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HNEl細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)BRD7具有抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，并通過(guò)Ras/MEK/ERK和Rb/E2F兩條通路影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞停滯于G0/G1期。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，BRD7蛋白在HNE1細(xì)胞定位于胞核，并能與核轉(zhuǎn)錄因子E1B-AP5、IRF2發(fā)生

5、交互作用，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。 【方法】 本研究將采用RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色、Western blot等方法檢測(cè)人類不同類型急性白血病和白血病細(xì)胞系中BRD7的表達(dá)，分析BRD7表達(dá)與急性白血病病人臨床特征的相關(guān)性；應(yīng)用PCR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和直接測(cè)序法檢測(cè)BRD7基因點(diǎn)突變或單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以進(jìn)一步探討B(tài)RD7基因的遺傳變異與急性白血病發(fā)生的聯(lián)系：通過(guò)電轉(zhuǎn)染建立瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)BRD7基因的白血

6、病細(xì)胞系K562，并借助熒光蛋白(GFP)標(biāo)志及流式細(xì)胞術(shù)分析BRD7基因?qū)?xì)胞周期和凋亡的影響。 【結(jié)果】 第一部分BRD7基因在白血病細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義 1.BRD7基因在白血病病人中的表達(dá) 52例急性白血病患者和32例正常對(duì)照的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的總RNA經(jīng)RT-PCR后均擴(kuò)增出一條259bp的目的cDNA片段，提示白血病細(xì)胞和正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞均表達(dá)BRD7。與內(nèi)參GAPDH相比，急性淋巴細(xì)胞白血

7、病患者和急性非淋巴細(xì)胞白血病患者之間BRD7的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，但病例組BRD7的相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，兩兩比較有顯著性差異(t=3.672 P=0.001；t=2.148 P=0.037)。 2.BRD7蛋白在白血病病人中的表達(dá) 利用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)了7例急性白血病患者和3例正常骨髓對(duì)照的骨髓細(xì)胞涂片，結(jié)果顯示在急性白血病患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中BRD7陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分率較高。 3

8、.BRD7基因與白血病患者白細(xì)胞和血小板數(shù)的相關(guān)性 經(jīng)Kenda11’s tau-b相關(guān)分析，結(jié)果顯示52例急性白血病患者BRD7基因的表達(dá)水平與其外周血白細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.086，P=0.376)；與外周血血小板數(shù)亦無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.011，P=0.912)。 4.BRD7基因在血液系惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá) 利用RT-PCR檢測(cè)血液系惡性腫瘤細(xì)胞系BRD7 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示人類白血病細(xì)胞系

9、K562、HL-60和Jurkat細(xì)胞、人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM3、人非何杰金淋巴瘤細(xì)胞系Raji和人永生化的正常淋巴細(xì)胞B958均明確表達(dá)BRD7，但BRD7基因在K562細(xì)胞呈低表達(dá)。 5.BRD7蛋白在血液系惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá) 在人類白血病細(xì)胞系K562、HL-60和Jurkat細(xì)胞、人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM3、人非何杰金淋巴瘤細(xì)胞系Raji和人永生化的正常淋巴細(xì)胞B958中均存在BRD7蛋白的表達(dá)，但在K56

10、2細(xì)胞BRD7表達(dá)水平相對(duì)較低。 第二部分 BRD7單核苷酸多態(tài)性分析 1.PCR-SSCP初步篩選BRD7基因點(diǎn)突變 在30例正常人對(duì)照、52例急性白血病患者及30例正常骨髓對(duì)照的取樣中發(fā)現(xiàn)部分樣品擴(kuò)增的基因片段在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有異常遷移現(xiàn)象，提示BRD7基因的第440～840位堿基可能存在突變或多態(tài)性。 2.DNA序列分析鑒定BRD7 SNP的基因型 DNA測(cè)序法成功地完成了BRD7等位

11、基因分型。在BRD7基因編碼區(qū)(440～840bp)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)cSNP(coding region SNP)，即C657A、C495T和A737G，其中C657A顛換導(dǎo)致其編碼蛋白的第181位氨基酸由天門(mén)冬酰胺替換為賴氨酸；C495T和A737G多態(tài)性偶聯(lián)發(fā)生，前者為同義cSNP，后者使得編碼蛋白的第208位氨基酸由谷氨酸置換為甘氨酸。 3.BRD7 SNP在白血病和對(duì)照中的基因型 分布兩組中BRD7基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的

12、基因型均有3種，即純合子突變型、雜合子突變型和正常型。A737G基因型頻率急性白血病組中為從：11.5％， AG：32.7％，GG：55.8％，A和G等位基因頻率分別為27.9％和72.1％；對(duì)照組中為從：38.4％，AG：28.3％，GG：33.3％，A和G等位基因頻率分別為53.4％和46.6％。兩組中A737G多態(tài)性的基因型頻率和等位--基因頻率均存在顯著性差異(X2=25.76，P<0.01)。危險(xiǎn)性分析表明，基因型GG和AG的

13、相對(duì)危險(xiǎn)度分別為5.33和5.86(OR值為1.12和1.23，95％置信區(qū)間分別為1.02～1.23和0.55～2.77)。C495T與A737G偶聯(lián)，基因型頻率及其分布同A737G。C657A多態(tài)性的基因頻率在病例和對(duì)照中無(wú)顯著性差異。 4.在白血病中A737G三種基因型 BRD7 mRNA表達(dá)的比較在急性白血病中，BRD7mRNA相對(duì)內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量以737GG基因型最高，為0.512±0.192，737AG

14、型最低，為0.467±0.108，但三者間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 第三部分 BRD7對(duì)白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞周期和凋亡的影響 1.BRD7在K562細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位 將pEGFP-C2/BRD7表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞，利用其表達(dá)的綠色熒光蛋白(GFP)介導(dǎo)亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示在K562細(xì)胞中BRD7蛋白定位于細(xì)胞核，呈細(xì)點(diǎn)狀、條索狀分布，相對(duì)均勻，與染色質(zhì)的分布存在一定程度的相似

15、性。 2.BRD7對(duì)白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞周期和凋亡的影響 分別將pEGFP-C2/BRD7表達(dá)質(zhì)粒和pEGFP-C2空白載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞系K562，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在K562細(xì)胞系中BRD7既能部分阻滯細(xì)胞周期GO/G1→S期的進(jìn)程，又具有明顯的細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能。 【結(jié)論】 1.急性白血病病人和正常骨髓對(duì)照的骨髓單個(gè)核細(xì)胞均表達(dá)BRD7，且該基因在急性白血病細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。 2.

16、BRD7基因參與了急性白血病的發(fā)病過(guò)程，但BRD7基因mRNA的表達(dá)水平與急性白血病患者初治時(shí)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)無(wú)相關(guān)性。 3.血液系惡性腫瘤細(xì)胞系K562、HL一60、Jlwkat、KM3、Raji和永生化的正常淋巴細(xì)胞B958均表達(dá)BRD7，其中K562細(xì)胞BRD7呈低表達(dá)。 4.BRD7基因編碼區(qū)(440～840bp)存在3個(gè)SNPs(C657A、C495T和A737G)，其中C450T和A737C偶聯(lián)，