家族型肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型腰段脊髓前角細(xì)胞雄激素受體的表達(dá)特征.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）是一種病因未明神經(jīng)系統(tǒng)變性病，選擇性損傷大腦皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核神經(jīng)元、脊髓前角a運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，導(dǎo)致進(jìn)行性加重的肌肉無(wú)力、萎縮，最終因呼吸肌麻痹死亡。有許多流行病學(xué)的危險(xiǎn)因素，例如暴露于重金屬、電或機(jī)械損傷、劇烈的體育活動(dòng)都會(huì)影響到肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的發(fā)病。但是還有兩個(gè)廣為接受的危險(xiǎn)因素:年齡和性別。研究表明男性發(fā)病率高于女性，49歲以前

2、男女發(fā)病率之比為3.98∶1，55歲以后男女發(fā)病率之比為1.63∶1;且男性發(fā)病早于女性[1];家族性ALS動(dòng)物模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病時(shí)間雄性早于雌性，生存時(shí)間雌性大于雄性[2]，說(shuō)明性別可能是其ALS發(fā)病的危險(xiǎn)因素，性激素可能對(duì)ALS發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元的變性、丟失發(fā)揮作用。
　　另有研究發(fā)現(xiàn)ALS患者男性以肢體發(fā)病為主，女性以球部發(fā)病為主[1]。肯尼迪病是一種X-連鎖的雄激素受體基因突變引起的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，主要影響高

3、位頸髓及延髓的下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，以上肢發(fā)病常見(jiàn)[3]。家族性肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型(SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠)的特征性臨床表現(xiàn)為成年（12周左右）發(fā)病，后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙并逐漸進(jìn)展至終末期(17-20周)[4]。目前有關(guān)雄激素受體(AR)在ALS小鼠脊髓表達(dá)情況的報(bào)道少見(jiàn)。
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光的方法，觀察家族型肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠）病程腰段脊髓前角細(xì)胞雄激素受體的表達(dá)與分布情況，應(yīng)用免疫組化的方法計(jì)數(shù)

4、家族型肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠）病程腰段脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目及觀察運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元雄激素受體的表達(dá)情況，旨在探討ALS的發(fā)病過(guò)程中雄激素受體的作用，為ALS發(fā)病機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、模型建立及分組
　　B6SJL-BTg(SOD1G93A)1Gur/J半合子雄鼠與B6SJLF1/J+/+雌鼠1∶1雜交，在恒溫、恒濕、12h光照/黑暗交替循環(huán)、無(wú)特殊病原菌的(Specif

5、icpathogenfree，SPF)環(huán)境中，喂以滅菌的SPF級(jí)顆粒型鼠類飼料及滅菌水，經(jīng)剪尾尖提取DNA、PCR擴(kuò)增后、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示(Fig.1):位于200-300bp之間的條帶(236bp)為mSOD1的PCR產(chǎn)物，此種小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。沒(méi)有此條帶為非mSOD1的PCR產(chǎn)物，為非SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠。
　　參考VercelliA[5]等的1-5分評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分，4分為發(fā)病時(shí)間，1分為死亡時(shí)間，

6、60天為癥狀前期，4分為癥狀早期，1分為終末期。各對(duì)照組為同窩、同月齡未轉(zhuǎn)人突變的SOD1基因的小鼠。每組雌雄各3只小鼠。
　　2、取材
　　10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠腰段脊髓，以4％多聚甲醛固定48h。
　　3、免疫熒光
　　后固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用免疫熒光三標(biāo)染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察雄激素受體在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段

7、脊髓前角中的細(xì)胞定位。
　　4、免疫組化染色
　　后固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用ABC方法進(jìn)行SMI-32及AR免疫組化染色，計(jì)數(shù)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量及觀察運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元AR受體表達(dá)。脊髓前角α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量的計(jì)數(shù)方法:對(duì)連續(xù)切片的每第五張切片的雙側(cè)脊髓前角的α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)，每段腰髓觀察10個(gè)切片。被計(jì)數(shù)的α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)準(zhǔn)為:位于前角、直徑＞25μm，細(xì)胞核清楚[6]。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPS

8、S13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示腰膨大脊髓切片兩側(cè)神經(jīng)元計(jì)數(shù)之和，三組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的t檢驗(yàn)，以a=0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1、模型建立
　　如Fig.1所示:位于200-300bp之間的條帶(236bp)為mSOD1的PCR產(chǎn)物，此種小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。沒(méi)有此條帶為非mSOD1的PCR產(chǎn)物，為非SOD1

9、G93A轉(zhuǎn)基因鼠。
　　2、免疫熒光
　　SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有雄激素受體表達(dá)，且位于胞漿，而星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均無(wú)雄激素受體表達(dá);對(duì)照組與ALS小鼠一致(Fig.2)。
　　3、免疫組化染色(SMI-32)
　　SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為20.67±2.92、14.73±2.84、8.47±2.72，各組比較P值分別為0.000、0.0

10、00、0.000，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.3，Table1)。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為20.60±3.20、17.47±3.40、8.47±3.44，各組比較P值分別為0.015、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.4，Table2)。雄雌對(duì)比，P值分別為0.953、0.024、1.000，僅發(fā)病期差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.5，Table3)。
　　4、免疫組化染

11、色（AR）
　　4.1與免疫熒光結(jié)果一致，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠AR表達(dá)于脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，且位于胞漿，胞漿著色均勻一致，隨病情進(jìn)展，未出現(xiàn)顆粒樣沉積。對(duì)照組與ALS小鼠一致（Fig.6）。
　　4.2SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為20.87±1.81、14.93±1.67、8.67±1.23，各組比較P值分別為0.000、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.7

12、，Table4)。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為20.80±1.97、17.67±2.13、8.67±1.59，各組比較P值分別為0.000、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.8，Table5)。雄雌對(duì)比，P值分別為0.924、0.001、1.000，僅發(fā)病期差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.9，Table6)。
　　5、免疫組化(SMI-32)和免疫組化（AR）的比較
　

13、　SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠各期SMI-32免疫陽(yáng)性的神經(jīng)元計(jì)數(shù)與AR免疫陽(yáng)性的神經(jīng)元計(jì)數(shù)相比，P值分別0.823、0.816、0.798，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.10，Table7)。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠P值分別為0.839、0.848、0.840，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.11，Table8)。
　　結(jié)論:
　　1.正常小鼠腰段脊髓前角細(xì)胞:雄激素受體(AR)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)，且位于胞漿，星型膠質(zhì)細(xì)胞